معلومة

مؤلفات عن تطبيق الإنزيم الصناعي

مؤلفات عن تطبيق الإنزيم الصناعي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن لأي شخص أن يوجهني إلى الأدبيات (المراجعات أو كتب العمل الأفضل) التي تصف التفاعلات الكيميائية الصناعية التي تحفزها الإنزيمات؟

أكثر ما يهمني هو دراسات الحالة حول كيفية تحسين ناتج التفاعل على نطاق واسع فيما يتعلق بنشاط الإنزيم.

تدور معظم المؤلفات التي أجدها حول تحسين نمو الخلايا ، وهذا ليس ما أبحث عنه.


سأعطيكم أمثلة صادفتها في المحادثات. هناك العديد من الاختلافات والأنواع من التطبيقات التي يمكنني استخدامها بطريقة شاملة.

مثال 1: إنتاج الإنزيم. يتعلق هذا النوع من التطبيق بتحسين كمية الإنزيم أو البروتين المرغوب فيه المنتج من مزرعة سائلة. آسف إذا كان هذا قريبًا جدًا من نمو الخلايا ، لكنه مهم للغاية. تُستخدم مزارع الخلايا الصغيرة في الأبحاث وعلم الوراثة للخلايا (عادةً e coli أو الخميرة ، ولكن أيضًا في كثير من الأحيان فطر تم العثور عليه في مكان ما) لتحسين كمية البروتين المطلوب. قد يُفرز البروتين ، مما يجعل تنقيته أسهل بكثير.

بمجرد العثور على سلالة جيدة ، يتم توسيع نطاق الثقافة إلى آلاف اللترات ، وغالبًا ما يمكن إنتاج عدة كيلوغرامات من الإنزيم النقي بهذه الطريقة. أمثلة: الإنزيمات التي تكسر نسيج الجينز المغسول بالحمض ، والبروتياز والكتينازات الموجودة في منظف الغسيل والأنسولين.

المثال 2: الجلوكوز أيزوميراز. يستخدم هذا الإنزيم لإنتاج شراب الذرة عالي الفركتوز. يقوم الإنزيم نفسه في الواقع بتحويل الفركتوز إلى جلوكوز ، ولكن وفقًا لمبدأ لو شاتلييه ، فإن شراب الجلوكوز تحت ضغط مرتفع سيتحول إلى سكر الفواكه بواسطة الإنزيم. يتم تثبيت هذا الإنزيم ، الذي يتم إنتاجه بواسطة عملية صناعية مثل تلك الموصوفة في المثال 1 ، على الراتنج ويتم تعبئته في أعمدة صناعية كبيرة الحجم. يبدو أنني أتذكر من الحديث أنهم كانوا متشابهين في الحجم مع برميل النفط. يتم تمرير كميات كبيرة من شراب الذرة الغني بالجلوكوز عبر العمود ؛ يخرج حوالي 40٪ من الفركتوز.

مثال آخر (3) على طول هذه الخطوط قد يكون كيفية استخدام إنزيم مع منتج. في عملية التصنيع الصناعية مثل معالجة الدنيم بالإنزيم ، يمكن غسل القماش في محلول بما في ذلك الإنزيم. يجب أن تكون العملية حريصة على التحكم في كمية الإنزيم التي يتعرض لها الدنيم ولتحسين الظروف بحيث لا يتلف أي من القماش بل يخرج باستمرار. قد يُقتل الإنزيم عن طريق تغيير الأس الهيدروجيني أو التسخين. هذا هو في الأساس هندسة كيميائية وهناك دورات حول هذا النوع من الأشياء في معظم أقسام ChemE الرئيسية الآن.


تقنية الإنزيم: التطبيق والإنتاج التجاري للإنزيمات

الإنزيمات هي المحفزات الحيوية التي تصنعها الخلايا الحية. إنها جزيئات بروتينية معقدة تؤدي إلى تفاعلات كيميائية معنية بالحياة. من حسن الحظ أن الإنزيمات تستمر في العمل (تخرج الحفز) عندما يتم فصلها عن الخلايا ، أي في المختبر. في الأساس ، الإنزيمات غير سامة وقابلة للتحلل. يمكن إنتاجها بكميات كبيرة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة للتطبيقات الصناعية.

تتضمن تقنية الإنزيم على نطاق واسع إنتاج وعزل وتنقية واستخدام الإنزيمات (في شكل قابل للذوبان أو غير متحرك) لصالح البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد تقنية الحمض النووي المؤتلف وهندسة البروتين المتضمنة في إنتاج إنزيمات أكثر كفاءة ومفيدة جزءًا من تقنية الإنزيم.

يعد الإنتاج التجاري للإنزيمات واستخدامها جزءًا رئيسيًا من صناعة التكنولوجيا الحيوية. ساهمت تخصصات مثل كيمياء الأحياء الدقيقة وهندسة العمليات ، إلى جانب الكيمياء الحيوية إلى حد كبير في نمو تكنولوجيا الإنزيم.

تطبيقات الانزيمات:

للإنزيمات مجموعة واسعة من التطبيقات. وتشمل هذه استخدامها في إنتاج الأغذية ، وتجهيز الأغذية وحفظها ، ومساحيق الغسيل ، وصناعة المنسوجات ، وصناعة الجلود ، وصناعة الورق ، والتطبيقات الطبية ، وتحسين البيئة والبحث العلمي.

وفقًا للتقديرات الحديثة ، فإن الغالبية العظمى من الإنزيمات المنتجة صناعيًا مفيدة في العمليات المتعلقة بالأغذية (45٪) والمنظفات (35٪) والمنسوجات (10٪) والجلود (3٪). للحصول على تفاصيل حول تطبيقات الإنزيمات الفردية ، يجب الرجوع إلى الجداول 21.1-21.3.

الإنتاج التجاري للأنزيمات:

تم استخدام الإنزيمات الميكروبية لعدة قرون دون معرفتها بشكل كامل. كان أول إنزيم تم إنتاجه صناعيًا هو تاكا دياستاز (أحد الأميليز الفطري) في عام 1896 في الولايات المتحدة. تم استخدامه كعامل صيدلاني لعلاج اضطرابات الجهاز الهضمي.

في أوروبا ، كانت هناك ممارسة عمرها قرون من تليين الجلود باستخدام براز الكلاب والحمام قبل الدباغة. أظهر عالم ألماني (أوتو روم) في عام 1905 أن المستخلصات من الأعضاء الحيوانية (البنكرياس من الخنازير والبقر) يمكن استخدامها كمصدر للإنزيمات - البروتياز ، لتليين الجلد.

بدأ استخدام الإنزيمات (بشكل رئيسي البروتياز) لأغراض الغسيل في عام 1915. ومع ذلك ، لم يستمر ذلك بسبب ردود الفعل التحسسية للشوائب في الإنزيمات. تتوفر الآن تقنيات خاصة لتصنيع واستخدام الإنزيمات في مساحيق الغسيل (بدون تفاعلات حساسية). يمكن إنتاج الإنزيمات التجارية من مجموعة واسعة من المصادر البيولوجية. في الوقت الحاضر ، الغالبية العظمى (80٪) منهم من مصادر ميكروبية.

فيما يلي الكائنات الحية المختلفة ومساهمتها النسبية في إنتاج الإنزيمات التجارية:

حدث اختراق حقيقي للإنتاج الصناعي على نطاق واسع للأنزيمات من الكائنات الحية الدقيقة بعد الخمسينيات من القرن الماضي.

إنزيمات من مصادر حيوانية ونباتية:

في الأيام الأولى ، ساهمت المصادر الحيوانية والنباتية بشكل كبير في إنتاج الإنزيمات. حتى الآن ، بالنسبة لبعض الإنزيمات فهي المصادر الرئيسية.

يتم إعطاء قائمة مختارة من الإنزيمات النباتية (الجدول 21.1) والحيوان (الجدول 21.2) مع مصادرها وتطبيقاتها:

تعد الأعضاء والأنسجة الحيوانية مصادر جيدة جدًا للإنزيمات مثل الليباز والإسترات والبروتياز. يتم الحصول على إنزيم الليزوزيم في الغالب من بيض الدجاج. تعتبر بعض النباتات مصادر ممتازة لبعض الإنزيمات - البابايا (البابايا) والبروميلين (الأناناس).

هناك عدة عيوب مرتبطة بتصنيع الإنزيمات من مصادر حيوانية ونباتية. الكميات محدودة وهناك تباين كبير في توزيعها. أهم القيود هي الصعوبات في عزل وتنقية الإنزيمات وعامل التكلفة. فيما يتعلق باستخراج الأنزيمات الصناعية من مصادر الأبقار ، هناك خطر كبير للتلوث بالدماغ الإسفنجي البقري والتهاب الدماغ (مرض جنون البقر هو مرض بريون ناجم عن تناول بروتينات غير طبيعية). لهذه الأسباب ، يفضل الإنتاج الميكروبي للإنزيمات.

إنزيمات من مزارع خلايا الثدييات:

توجد إمكانية لإنتاج إنزيمات تجارية مباشرة عن طريق مزارع خلايا الثدييات. لكن القيد الرئيسي سيكون عامل التكلفة الذي سيكون مرتفعًا للغاية. ومع ذلك ، يتم إنتاج بعض الإنزيمات العلاجية مثل منشط البلازمينوجين النسيجي بواسطة مزارع الخلايا.

إنزيمات من مصادر جرثومية:

الكائنات الحية الدقيقة هي أهم مصادر الإنزيمات التجارية وأكثرها ملاءمة. يمكن تصنيعها لإنتاج كميات وفيرة من الإنزيمات في ظل ظروف نمو مناسبة. يمكن زراعة الكائنات الحية الدقيقة باستخدام وسائط غير مكلفة ويمكن أن يتم الإنتاج في فترة قصيرة.

بالإضافة إلى ذلك ، من السهل معالجة الكائنات الحية الدقيقة في تقنيات الهندسة الوراثية لزيادة إنتاج الإنزيمات المرغوبة. تكون عمليات الاسترداد والعزل والتنقية سهلة باستخدام الإنزيمات الميكروبية مقارنة بالمصادر الحيوانية أو النباتية.

في الواقع ، تم إنتاج معظم إنزيمات التطبيقات الصناعية بنجاح بواسطة الكائنات الحية الدقيقة والخجولة. يتم استخدام الفطريات والبكتيريا والخمائر المختلفة لهذا الغرض. ترد قائمة مختارة من الإنزيمات والمصادر الميكروبية والتطبيقات في الجدول 21.3.

Aspergillus niger - كائن فريد من نوعه لإنتاج الإنزيمات السائبة:

من بين الكائنات الحية الدقيقة ، يحتل A. niger (فطر) مكانة خاصة لتصنيع عدد كبير من الإنزيمات بكميات جيدة. يوجد أكثر من 40 إنزيمًا تجاريًا تم إنتاجها بسهولة بواسطة A. niger. وتشمل هذه الأميلاز ، السليولاز ، البروتياز ، الليباز ، البكتيناز ، الفايتيز ، الكاتلاز والأنسوليناز.

تكنولوجيا إنتاج الإنزيم - اعتبارات عامة:

بشكل عام ، التقنيات المستخدمة في الإنتاج الميكروبي للإنزيمات يمكن مقارنتها بالطرق المستخدمة في تصنيع المنتجات الصناعية الأخرى. تم وصف السمات البارزة بإيجاز.

4. استعادة وتنقية الانزيمات.

يوضح الشكل 21.1 مخططًا لمخطط التدفق لإنتاج الإنزيم بواسطة الكائنات الحية الدقيقة.

اختيار الكائن الحي:

تتمثل أهم معايير اختيار الكائن الدقيق في أن الكائن الحي يجب أن ينتج الكميات القصوى من الإنزيم المطلوب في وقت قصير بينما تكون كميات المستقلب الأخرى المنتجة في حدها الأدنى. بمجرد اختيار الكائن الحي ، يمكن إجراء تحسين السلالة لتحسين إنتاج الإنزيم بالطرق المناسبة (المطفرات ، الأشعة فوق البنفسجية). من الكائن الحي المختار ، يمكن تحضير اللقاح في وسط سائل.

صياغة الوسط:

يجب أن يحتوي وسط الاستزراع المختار على جميع العناصر الغذائية لدعم النمو الكافي للكائنات الحية الدقيقة التي ستؤدي في النهاية إلى كميات جيدة من إنتاج الإنزيم. يجب أن تكون مكونات الوسط متاحة بسهولة بتكلفة منخفضة وآمنة من الناحية التغذوية. بعض الركائز المستخدمة بشكل شائع للوسط هي تحلل النشا ، دبس السكر ، خمور الذرة ، خلاصة الخميرة ، مصل اللبن ، ووجبة فول الصويا. كما تم استخدام بعض الحبوب (القمح) والبقول (الفول السوداني). يجب أن يبقى الأس الهيدروجيني للوسط مثالياً للنمو الميكروبي الجيد وإنتاج الإنزيم.

يتم تنفيذ الإنتاج الصناعي للإنزيمات في الغالب عن طريق ظروف السائل المغمور وبدرجة أقل عن طريق تخمير الركيزة الصلبة. في تقنية الاستزراع المغمور ، تكون الغلات أكثر وتكون فرص الإصابة أقل. ومن ثم ، فهذه هي الطريقة المفضلة. ومع ذلك ، فإن تخمير الركيزة الصلبة مهم تاريخيًا ولا يزال قيد الاستخدام لإنتاج الإنزيمات الفطرية على سبيل المثال. الأميليز والسليولاز والبروتياز والبكتينازات.

يمكن تعقيم الوسيط عن طريق استخدام تقنيات التعقيم المتواصل أو الدفعي. يبدأ التخمير بتلقيح الوسط. ظروف النمو (درجة الحموضة ، درجة الحرارة ، O2 الإمداد ، إضافة المغذيات) عند المستويات المثلى. يمكن تقليل تكوين الرغوة عن طريق إضافة عوامل مضادة للرغوة.

يتم إنتاج الإنزيمات في الغالب عن طريق التخمير الدفعي وبدرجة أقل من خلال عملية مستمرة. يجب الحفاظ على نظام المفاعلات الحيوية معقمًا طوال عملية التخمير. تختلف مدة التخمير من 2 إلى 7 أيام ، في معظم عمليات الإنتاج. إلى جانب الإنزيم (الإنزيمات) المرغوبة ، يتم أيضًا إنتاج العديد من المستقلبات الأخرى. يجب استعادة الإنزيم (الإنزيمات) وتنقيته.

استعادة وتنقية الانزيمات:

قد يُفرز الإنزيم المطلوب الناتج في وسط المزرعة (إنزيمات خارج الخلية) أو قد يكون موجودًا داخل الخلايا (إنزيمات داخل الخلايا). اعتمادًا على المتطلبات ، قد يكون الإنزيم التجاري خامًا أو عالي النقاء. علاوة على ذلك ، قد يكون في صورة صلبة أو سائلة. ستعتمد الخطوات المتضمنة في المعالجة النهائية ، أي خطوات الاسترداد والتنقية المستخدمة ، على طبيعة الإنزيم ودرجة النقاء المطلوبة.

بشكل عام ، يعد استرداد إنزيم خارج الخلية موجود في المرق أبسط نسبيًا مقارنة بالإنزيم داخل الخلايا. لإطلاق الإنزيمات داخل الخلايا ، هناك حاجة لتقنيات خاصة لاضطراب الخلية. يجب على القارئ إحالتها الآن بشكل ثابت ومعرفة كل التفاصيل ، لأنها تشكل جزءًا من تقنية الإنزيم. يمكن تفكيك الخلايا الميكروبية بالوسائل الفيزيائية (صوتنة ، ضغط عالي ، خرز زجاجي). يمكن أن تتحلل جدران الخلايا البكتيرية بواسطة إنزيم الليزوزيم. بالنسبة للخمائر ، يتم استخدام إنزيم β-glucanase. ومع ذلك ، فإن الأساليب الأنزيمية باهظة الثمن.

ستكون خطوات الاسترداد والتنقية (الموصوفة بإيجاز أدناه) هي نفسها لكل من الإنزيمات داخل الخلايا وخارجها ، بمجرد أن تتعطل الخلايا ويتم إطلاق الإنزيمات داخل الخلايا. الاعتبار الأكثر أهمية هو تقليل فقدان نشاط الإنزيم المطلوب.

إزالة بقايا الخلايا:

يمكن استخدام الترشيح أو الطرد المركزي لإزالة حطام الخلية.

إزالة الأحماض النووية:

تتداخل الأحماض النووية مع استعادة الإنزيمات وتنقيتها. يمكن ترسيبها وإزالتها عن طريق إضافة بولي كاتيونات مثل البولي أمينات والستربتومايسين والبولي إيثيلين أمين.

يمكن ترسيب الإنزيمات باستخدام أملاح (كبريتات الأمونيوم) المذيبات العضوية (الأيزوبروبانول والإيثانول والأسيتون). يعتبر الترسيب مفيدًا حيث يمكن إذابة الإنزيم المترسب في حجم ضئيل لتركيز الإنزيم.

قسم السائل السائل:

يمكن تحقيق مزيد من التركيز للإنزيمات المرغوبة عن طريق الاستخراج السائل والسائل باستخدام البولي إيثيلين جلايكول أو البولي أمينات.

الفصل بالكروماتوغرافيا:

توجد عدة تقنيات كروماتوجرافية لفصل وتنقية الإنزيمات. وهي تشمل التبادل الأيوني ، واستبعاد الحجم ، والتقارب ، والتفاعل الكارهة للماء ، وكروماتوجرافيا الصبغة.

يمكن الحصول على الشكل المركز للإنزيم بالتجفيف. يمكن القيام بذلك عن طريق مبخرات الأفلام أو المجففات بالتجميد (المجففات). يمكن تعبئة وتسويق الإنزيم المجفف. بالنسبة لبعض الإنزيمات ، يمكن تحقيق الاستقرار من خلال الاحتفاظ بها في معلقات كبريتات الأمونيوم.

يجب أن تكون جميع الإنزيمات المستخدمة في الأطعمة أو العلاجات الطبية ذات درجة نقاء عالية ، ويجب أن تفي بالمواصفات المطلوبة من قبل الجهات الرقابية. يجب أن تكون هذه الإنزيمات خالية تمامًا من المواد السامة والكائنات الدقيقة الضارة ويجب ألا تسبب تفاعلات حساسية.

تنظيم إنتاج الإنزيم الميكروبي - اعتبارات عامة:

يمكن تحقيق أقصى إنتاج للإنزيمات الميكروبية عن طريق تحسين ظروف التخمير (العناصر الغذائية ، درجة الحموضة ، O2ودرجة الحرارة وما إلى ذلك). لهذا الغرض ، يلزم فهم واضح للتنظيم الجيني لتخليق الإنزيم. يتم وصف بعض الجوانب العامة لتنظيم الإنزيم الميكروبي بإيجاز.

يمكن تحفيز العديد من الإنزيمات ، أي يتم تصنيعها فقط في وجود المحرضات. قد يكون المحفز هو الركيزة (السكروز ، النشا ، الجالاكتوزيدات) أو المنتج أو الوسيط (الأحماض الدهنية ، أسيتات الفينيل ، الزيلوبيوز). يتم إعطاء قائمة مختارة من الإنزيمات المحفزة والمحفزات ذات الصلة في الجدول 21.4.

المركبات المحفزة غالية الثمن كما أن التعامل معها (التعقيم والإضافة في وقت محدد) صعب للغاية. في السنوات الأخيرة ، تُبذل محاولات لتطوير طفرات من الكائنات الحية الدقيقة التي يتم فيها التخلص من الاعتماد على المحرض.

قمع التعليقات:

يؤثر تنظيم التغذية الراجعة للمنتج النهائي (عادة جزيء صغير) بشكل كبير على تخليق الإنزيم. يحدث هذا عندما يتراكم المنتج النهائي بكميات كبيرة. يعد إنتاج الإنزيمات المنظمة للردود على نطاق واسع أمرًا صعبًا إلى حد ما. ومع ذلك ، فقد تم تطوير المسوخات التي تفتقر إلى قمع التغذية المرتدة للتغلب على هذه المشكلة.

قمع المغذيات:

تم تصميم عملية التمثيل الغذائي الأصلية للكائنات الحية الدقيقة بحيث لا يحدث أي إنتاج للإنزيمات غير الضرورية. بمعنى آخر ، لا تصنع الكائنات الحية الدقيقة الإنزيمات التي لا تتطلبها ، لأن هذا يعد تمرينًا مهدرًا. يتم تثبيط إنتاج الإنزيم غير المرغوب فيه عن طريق كبت المغذيات. قد تكون المغذيات عبارة عن كربون أو نيتروجين أو فوسفات أو كبريتات في وسط النمو. من أجل إنتاج الإنزيمات على نطاق واسع ، يجب التغلب على قمع المغذيات.

قمع الجلوكوز هو مثال كلاسيكي على قمع المغذيات (الأنسب للهدم). في وجود الجلوكوز ، لا يتم تصنيع الإنزيمات اللازمة لعملية التمثيل الغذائي لبقية المركبات. يمكن التغلب على قمع الجلوكوز عن طريق تغذية الكربوهيدرات إلى وسط التخمير بحيث يكون تركيز الجلوكوز صفرًا تقريبًا في أي وقت. في السنوات الأخيرة ، تُبذل محاولات لاختيار طفرات مقاومة لقمع الهدم بواسطة الجلوكوز. بالنسبة لبعض الكائنات الحية الدقيقة ، تعمل مصادر الكربون الأخرى مثل البيروفات واللاكتات والسيترات والسكسينات أيضًا كمثبطات هدم.

كما لوحظ قمع مصدر النيتروجين في الكائنات الحية الدقيقة. قد يكون هذا بسبب أيونات الأمونيوم أو الأحماض الأمينية. تستخدم أملاح الأمونيوم الرخيصة في أغلب الأحيان كمصادر للنيتروجين. يمكن التغلب على قمع أملاح الأمونيوم من خلال تطوير طفرات مقاومة لمصدر النيتروجين هذا.

الهندسة الوراثية لإنتاج الإنزيمات الميكروبية:

الإنزيمات هي المنتجات الوظيفية للجينات. لذلك ، من الناحية النظرية ، تعتبر الإنزيمات مرشحة جيدة لتحسين الإنتاج من خلال الهندسة الوراثية. خلال الخمسة عشر عامًا الماضية ، ساعدت التطورات في تقنية الحمض النووي المؤتلف بالتأكيد في زيادة الإنتاج الميكروبي للإنزيمات التجارية. أصبح من الممكن الآن نقل جينات الإنزيم المرغوبة من كائن حي إلى آخر. بمجرد تحديد إنزيم له استخدام محتمل في الصناعة ، يمكن استنساخ الجين ذي الصلة وإدخاله في مضيف إنتاج مناسب.

استراتيجيات الاستنساخ:

يرد في الشكل 21.2 تمثيل تخطيطي لاستراتيجية الاستنساخ للإنتاج الصناعي للإنزيمات. يتضمن ذلك تطوير مكتبة (كدنا) للـ mRNA ، وإنشاء تحقيقات قليلة النوكليوتيد للإنزيم المطلوب. على التهجين مع تحقيقات قليل النوكليوتيد ، يمكن تحديد الحيوانات المستنسخة معينة (كدنا).

الخطوة التالية هي تحويل الكائن المضيف المهم صناعيًا (مثل Aspergillus oryzae) لإنتاج الإنزيم المطلوب. من خلال هذا النهج ، من الممكن تصنيع إنزيمات صناعية عالية الجودة. يتم وصف اثنين من الإنزيمات المنتجة عن طريق استخدام استراتيجيات الاستنساخ أدناه.

1. إنزيم الليبوليز الموجود في فطر Humicola laninosa فعال للغاية في إزالة بقع الدهون من الأقمشة. ومع ذلك ، فإن الإنتاج الصناعي للليبوليز بواسطة هذا الكائن غير ممكن بسبب المستوى المنخفض جدًا من التوليف. تم عزل الجين المسؤول عن إنزيم الليبوليز واستنساخه وإدخاله في Aspergillus oryzae.

وبالتالي ، تم تحقيق إنتاج واسع النطاق لهذا الإنزيم بنجاح. إن Lipolase مستقر للغاية ومقاوم للتحلل بواسطة البروتياز الذي يشيع استخدامه في المنظفات. كل هذه الخصائص تجعل الليبوليز مرشحًا قويًا لاستخدامه في غسل الأقمشة.

2. المنفحة (الكيموسين) هو إنزيم يستخدم على نطاق واسع في صناعة الجبن. يتم الحصول عليها بشكل رئيسي من معدة العجول الصغيرة. وبالتالي ، هناك نقص في المعروض منها. تم استنساخ الجين الخاص بتركيب الكيموسين لإنتاجه على نطاق واسع.

هندسة البروتينات لتعديل الانزيمات الصناعية:

من الممكن الآن تغيير بنية البروتين / الإنزيم عن طريق هندسة البروتين والطفرات الموجهة بالموقع. يتم إجراء التغييرات في الإنزيمات بهدف زيادة استقرار الإنزيم ووظيفته التحفيزية ، ومقاومة الأكسدة ، وتغيير تفضيل الركيزة و زيادة تحمل المذيبات القلوية والعضوية.

عن طريق الطفرات الموجهة للموقع ، يمكن تغيير الأحماض الأمينية المختارة في مواضع محددة (في الإنزيم) لإنتاج إنزيم بالخصائص المرغوبة. على سبيل المثال ، تم استخدام هندسة البروتين لتعديل إنزيم phospholipase A هيكليًا2 يمكنها مقاومة التركيز العالي للحمض. يستخدم الإنزيم المعدل بكفاءة أكبر كمستحلب غذائي. الهندسة الوراثية لها تأثير هائل على الإنتاج الصناعي للأنزيمات ذات الخصائص المرغوبة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.


إنزيمات

استخدامات صناعة الغذاء

أشار تقرير حديث عن سوق الولايات المتحدة للأنزيمات إلى أن إجمالي المبيعات بلغ 185 مليون دولار في عام 1985 ، 58٪ منها في صناعة المواد الغذائية (Charles Kline & # x00026 Co. ، 1986). من بين فئات الإنزيمات المستخدمة في صناعة الأغذية ، تمثل البروتياز والكربوهيدرات معظم هذا السوق. البروتياز السائد المباع هو رينين (الكيموسين) ، والذي يستخدم في عمليات صنع الجبن لتخثر الحليب لتكوين الخثارة. من بين الكربوهيدرات ، تمثل تلك المستخدمة في معالجة نشا الذرة (ما يسمى بإنزيمات النشا & # x003b1-amylase و glucoamylase و glucose isomerase) 85٪ من المبيعات. للأنزيمات الأخرى تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك تطوير النكهة (على سبيل المثال ، الليباز في صناعة الجبن) (Arbige et al. ، 1986) ، وتحسين الاستخلاص (على سبيل المثال ، البكتينازات في معالجة العصير) (Kilara ، 1982) ، وتعديل وظائف الطعام ( على سبيل المثال ، & # x003b1-amylases في تأخر تأخر الخبز) (Boyce ، 1986).

من الواضح أن تكنولوجيا تحسين إنتاج الإنزيمات الغذائية عن طريق الهندسة الوراثية موجودة (لين ، 1986). تم استنساخ جينات العديد من إنزيمات صناعة الأغذية المهمة (Meade et al. ، 1987) ، وتم تطوير أنظمة نقل الجينات التي تسمح بالتقديم والتعبير في كائنات آمنة (GRAS) المعترف بها عمومًا (Lin ، 1986). هناك تطبيقان حديثان ومهمان للهندسة الوراثية لإنتاج الإنزيمات هما & # x003b1-amylase و chymosin.

& # x003b1-Amylase: صناعة شراب الذرة عالي الفركتوز.

كان الالتماس الأول المقدم إلى إدارة الغذاء والدواء (FDA) لتأكيد حالة GRAS لإنزيم معالجة الأغذية الذي تنتجه تقنيات الحمض النووي المؤتلف هو & # x003b1-amylase. تم تقديم هذا الالتماس التاريخي من قبل CPC International، Inc. ، في 9 يوليو 1984.

& # x003b1-Amylase هو الإنزيم المستخدم في الخطوة الأولى في إنتاج شراب الذرة عالي الفركتوز (HFCS) ، وهو مُحلي مغذي يستخدم على نطاق واسع مشتق من نشا الذرة. تم تطوير عملية مركبات الكربون الهيدروفلورية لأول مرة في الولايات المتحدة بين عامي 1968 و 1972 من قبل شركة كلينتون لمعالجة الذرة (لويد وهوروث ، 1985) وتتضمن ثلاث خطوات إنزيمية متتابعة. أولاً ، يتم تسييل نشا الذرة الخام بواسطة التحلل المائي & # x003b1-amylase لإنتاج سلاسل نشا متحللة جزئيًا تسمى dextrins. يتم بعد ذلك تحلل الدكسترين بواسطة الجلوكوز أميليز ، والذي يشق كلاً من روابط الجلوكوزيد & # x003b1-1،6 و & # x003b1-1،4 لإعطاء شراب الذرة (الجلوكوز). يتم تنقية تحلل الجلوكوز هذا ومن ثم يتم تجزئته بواسطة إيزوميراز الجلوكوز الثابت لإعطاء مزيج من الجلوكوز والفركتوز (42٪) المعروف باسم HFCS. تم تسويق هذه الخطوة الأخيرة في عام 1972 وتمثل أول استخدام واسع النطاق لإنزيم ثابت يسمح بعملية مستمرة مع خفض كبير في التكلفة (Casey ، 1977). يمكن بعد ذلك تنقية 42٪ من مركبات الكربون الهيدروفلورية لإنتاج شراب من الجيل الثاني بنسبة 55٪ و 90٪ من الفركتوز (Coker and Venkatasubramanian، 1985).

نما سوق مركبات الكربون الهيدروفلورية بشكل كبير. زاد استهلاك الولايات المتحدة من 2.3 كجم / للفرد في عام 1975 إلى 20 كجم / للفرد في عام 1985 (Newsome ، 1986). اليوم ، يتجاوز الإنتاج 4.54 مليار كجم سنويًا. تُستخدم مركبات الكربون الهيدروفلورية في العديد من المنتجات الغذائية المصنعة وهي المُحلي الغذائي الرئيسي لصناعة المشروبات الغازية. جرانت (1986) ناقش مؤخرًا CPC المعدّل وراثيًا & # x003b1-amylase وعريضة تأكيد GRAS مع إدارة الغذاء والدواء. كان هدفه استخدام عصية الرقيقة كنظام مضيف للإنتاج التجاري لشكل مقاوم للحرارة من & # x003b1-amylase الذي طور CPC منه عصية stearothermophilus (Ishii et al. ، 1981) - كائن حي مُنح وضع GRAS بواسطة FDA (الشكل 1). هذا الشكل المستقر للحرارة والحمض من & # x003b1-amylase مهم لإنتاج منخفض التكلفة لمركبات الكربون الهيدروفلورية. إنتاجها في ب. الرقيقة كان المطلوب بسبب السهولة التي ب. الرقيقة يمكن استخدامها في التخمير التجاري.

وفقًا لعريضة CPC ، فإن السلالة المحددة باسم ب. الرقيقة تم اشتقاق ATCC 39 ، 705 وراثيًا من مجموعة متنوعة غير مسامية من ب. الرقيقة ATCC 39 ، 701 ، التي تفتقر إلى & # x003b1-amylase ، عن طريق إدخال مادة وراثية من ب. stearothermophilus ATCC 39 ، 709 لإنتاج & # x003b1-amylase. المعدلة وراثيا ب. الرقيقة يحتوي على DNA من ناقل بلازميد محدد باسم pCPC720. يتكون البلازميد من جزء 2.4 كيلو بايت من الحمض النووي الذي يشتمل على جين & # x003b1-amylase من ب. stearothermophilus وجزء من الحمض النووي من pUB110 البلازميد المطلوب لتكرار البلازميد الجديد. لا يحتوي pCPC720 على علامة مقاومة كاناميسين لـ pUB110 ، والخلايا المضيفة المحولة ليست مقاومة للكاناميسين.

شكل 1

معدلة وراثيا & # x003b1-amylase.

يقدم التماس CPC بيانات تميز الإنزيم والكائن المؤتلف لإظهار أن الإنزيم المعدل وراثيًا مكافئ من جميع النواحي لتلك التي تنتجها ب. stearothermophilus ولإثبات سلامة المنتج المؤتلف. سيتم استخدام الإنزيمات في عملية مركبات الكربون الهيدروفلورية فقط ولن تكون موجودة في المنتج الغذائي.

فيما يتعلق بعريضة CPC ، حث جرانت ، & # x0201c نحن بحاجة إلى قرارات تنظيمية تستند إلى أسس علمية ، ونحن بحاجة إلى إجراءات صناعية مسؤولة. . . . نظرًا لأن هذا هو الأول من بين العديد من الالتماسات التي يحتمل أن تراجعها إدارة الغذاء والدواء فيما يتعلق بالكائنات الدقيقة المؤتلفة ، يجب أن تكون إدارة الغذاء والدواء حذرة ودقيقة للغاية. سيحدد حكم إدارة الغذاء والدواء بشأن التماسنا سياسة الأحكام المستقبلية & # x0201d (جرانت ، 1986 ، ص 22). هذا هو الحال بلا شك: حصلت CPC في سبتمبر على براءة اختراع تغطي الهندسة الوراثية لـ ب. الرقيقة لإنتاج مادة بولولانيز صامدة للحرارة (Coleman and McAlister ، 1986). هناك العديد من التطورات المماثلة ، كما هو موضح في المثالين التاليين.

الكيموسين (رينين): صناعة الألبان. إنزيم آخر كان محور أبحاث الهندسة الوراثية الكبيرة هو الكيموسين ، وهو المكون النشط من المنفحة المستخدم في صناعة الألبان لتخثر الحليب لتكوين الخثارة في عملية صنع الجبن. الكيموسين هو بروتين داخلي خاص للغاية في التحلل المائي للببتيد في الروابط في الطيات V من الحليب كابا-كازين ، مما يؤدي إلى زعزعة استقرار مذيلات الكازين وتكوين الخثارة اللاحقة. المصادر التجارية هي منفحة العجل المستخرجة من المعدة الرابعة للعجول الرضيعة الصغيرة والمنفحات الميكروبية بشكل أساسي من الفطريات مكور ميهي, م. صديد، أو البطانة الطفيليات. تنتج هذه الفطريات الكيموسين مع اختلافات طفيفة في خصائص تخثر الحليب ، وفي استقرار الحرارة ودرجة الحموضة ، بالإضافة إلى نسبة تخثر / تحلل بروتين مختلفة عن تلك الموجودة في الكيموسين من مصادر العجل. وبالتالي ، يوجد طلب على الكيموسين على غرار منفحة العجل لاستخدامه في إنتاج أجبان عالية الجودة. أدت فرصة الإنتاج الميكروبي لكيموسين منفحة العجل إلى قيام العديد من الشركات بتطوير استراتيجيات لاستنساخ الجين الخاص بالكيموسين من مكتبات (كدنا) المشتقة من معدة العجل mRNA ولتحقيق التعبير عن الجين غير المتجانسة في العديد من الكائنات المضيفة (الشكل 2). في الجسم الحي ، يتم إنتاج الكيموسين على شكل بريبروشيموسين ، والذي يُفرز على شكل زيموجين ، بروشيموسين. في المحاليل منخفضة الأس الهيدروجيني ، يتم تحفيز البروشيموسين تلقائيًا إلى الكيموسين (McGuire ، 1986).

الشكل 2

إنتاج الكيموسين المعدل وراثيا.

الإشريكية القولونيةالكيموسين المنتج له عدة قيود (Pitcher ، 1986). يتراكم الإنزيم في السيتوبلازم ، مما يتطلب عملية مكلفة ومنخفضة العائد لاشتقاق الإنزيم النشط. تم استخدام نظامين مضيفين بديلين: ما يسمى بسلالات الخميرة supersecretor (التي تستخدمها شركة Collaborative Research ، Inc.) والفطريات الخيطية (التي تستخدمها شركة Genencor ، Inc.). استراتيجية Genencor ل فطر الرشاشيات تضمن إنتاج الكيموسين البقري (Heyneker et al. ، 1986 W.H. Pitcher ، Genencor ، الاتصالات الشخصية ، 1986) استخدام تركيبات جينية غير متجانسة في أ. nidulans المحولات التي تفرز الجين المنتج.

تتكون الإنشاءات البلازميدية من مناطق التحكم في أ. النيجر يرتبط جين الغراء أميلاز إما ببروشيموسين الأبقار أو بريبروشيموسين (كدنا) مع فاصل جلوكومايلاز. أ. nidulans تفرز المحولات الكيموسين ، والذي كان مشابهًا للكيموسين البقري الأصلي في الوزن الجزيئي والنشاط المحدد. يتم تقييم تجارب الجبن باستخدام مستحضرات الكيموسين (Pitcher ، 1986). وبالتالي ، يبدو أن الإنتاج التجاري للكيموسين المشابه لمنفحة العجل ممكن تقنيًا.

تشمل التطبيقات الأخرى للهندسة الوراثية لإنتاج الإنزيمات لصناعة الأغذية ما يلي: اللاكتاز ، لتحطيم لاكتوز ليباز الحليب وإستريز ، لتطوير نكهة الجبن البكتيناز ، لتحسين المحصول ، وتقليل اللزوجة ، وتعزيز التوضيح في معالجة عصير الفاكهة وصنع النبيذ البروتياز ، ليكون بمثابة بديل الشعير عند استخدامه مع الشعير والكربوهيدرات ، لتسهيل عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات في إنتاج البيرة منخفضة السعرات الحرارية.


الإنتاج الصناعي للأنزيمات (مع التطبيقات) | التكنولوجيا الحيوية

يتم وصف الإنتاج الصناعي للأميلاز ، أيزوميراز الجلوكوز ، البكتيناز ، الليباز ، السليلاز والبروتياز في هذه المقالة.

1. الأميليز :

الأميليز هي مجموعة معقدة من الإنزيمات التي تحلل السكريات مثل النشا والجليكوجين إلى الجلوكوز. أثناء التحلل المائي لـ 1 ، 4-glycoside ، تتحلل الروابط الموجودة في السكريات أعلاه مما يؤدي أولاً إلى تكوين دكسترينات قصيرة السلسلة ، ثم إلى المالتوز والجلوكوز. إنزيمات مختلفة تشارك في تحلل النشا إلى جلوكوز موضحة في الشكل 8.3 ومذكورة في الجدول 8.2 أ.

هناك مجموعتان رئيسيتان من الأميليز مثل -

1. تسمى α -amylose & # 8211 α -amylases أيضًا بـ 1،4 - α & ​​# 8211 glucan & # 8211 glucano hydrolase. تحلل الإنزيمات خارج الخلية روابط جليكوسيدية 1،4 & # 8211. تسمى هذه الإنزيمات أيضًا باسم الإنزيمات الداخلية لأنها تقسم الطبقة السفلية في داخل الجزيء بطريقة عشوائية. من ناحية أخرى،

2. β-amylose & # 8211 β-amylases يقسم الركيزة من أحد طرفي الجزيء بطريقة متتالية.

على كل 1 ، 4 رابطة جليكوسيدية بديلة تطلق المالتوز. تسمى هذه الإنزيمات أيضًا exo amylases. تشمل الإنزيمات الأخرى المشاركة في تحلل النشا amyloglycosidase (Aspergilus niger و Rhizopus niveus) و isoamylase و pullulanase (Klebsiella pneumoniae و Bacillus acidopullyticus). لا يختلف الوزن الجزيئي لمختلف α-amyloses بشكل كبير (الجدول 8.3) ويتطلب الكالسيوم كمثبت.

تفرز العديد من البكتيريا والفطريات α-amylases.

وهي مصنفة حسب:

1. تسييل النشا أو تأثير السكريات

تنتج الأميلازات السكارينية السكريات الحرة (بيتا-أميلوز وجلوكومايلاز) ، في حين أن الأميلوز النشا المسال (ألفا أميلوز) يكسر بوليمر النشا ولكنه لا ينتج السكريات الحرة.

البكتيريا التي تنتج α -amylase هي Bacillus subtilis و B. cereus و B.mylo- Licheniformis و B. coagulans و B. polymyxa و B. stearothermophilus و B. caldolyticus و B. acidocaldarius و B. subtilis amylosaccharaticus و B. من Lactobacillus و Micrococcus و Pseudomonas و Arthrobacter و Escherichia و Proteus و Thermomonospora و Serratia. بعض الفطريات المنتجة لـ α-amylase هي أنواع من Aspergillus و Penicillium و Cephalosporium و Mucor و Candida و Neurospora و Rhizopus.

على الرغم من أن جميع البكتيريا والفطريات المذكورة أعلاه قادرة على إنتاج α-amylase ، إلا أن أهمها التي يتم إنتاج α -amylase منها تجاريًا من خلال عملية التخمير تشمل Bacillus amyloliquefaciens و B. licheniformis و Aspergillus oryzae. ومع ذلك ، يتم استخدام Bacillus على نطاق واسع أكثر بكثير من تلك التي في Aspergillus. تم تحديد أهم مجالات التطبيق لهذين الإنزيمين في الجدول 8.4.

فطري α الأميليز:

يتم إنتاج الفطريات α-amylase تجاريًا عن طريق استخدام Aspergillus oryzae أو Aspergillus niger. يتم استخدام طريقة الاستزراع الثابت عند استخدام A. oryzae ، بينما يتم استخدام طريقة الاستزراع المغمور عند استخدام Aspergillus niger.

يتم وصف عملية طريقة الاستزراع المغمور هنا فقط:

(أ) إعداد اللقاح:

Suitable and pure seed culture is generally selected as inoculum. In certain cases mutants capable of giving higher yield are selected as inoculum.

(ب) Preparation of Medium:

The following medium is generally employed for submerged fermentation:

Amylase biosynthesis is inhibited when there is glucose in the medium. The medium is steam sterilized. The sterilized medium is passed into a production fermenter for α-amylase production.

(ج) Fermentation Process:

A cylindrical fermenter made up of stainless steel is generally used in the fermentation process. It is equipped with an agitator, an aerating device, a cooling system and other ancillary equipment like a device for foam control, monitoring of pH, temperature and control of oxygen tension etc.

A sufficient quantity of pre-sterilized production medium is taken in the fermenter and is inoculated with spores of the selected species of the fungus. The spores are allowed to germinate and produce sufficient mycelium by controlling the fermentation conditions. Control of fermentation conditions plays a vital role in the success of the process, which include pH, temperature, aeration, agitation, oxygen supply etc.

The optimum pH for the fermentation is 7.0. Calcium carbonate is used as buffer to maintain pH. The fermentation process is generally operated at a temperature of 30 to 40°C. Aeration and agitation of the production medium is needed because of high viscosity of the medium due to the presence of mycelial mat.

(د) Harvest and Recovery:

The following steps are followed during the recovery of the enzyme after the completion of fermentation. In order to avoid denaturation of the enzyme, the fermentation broth is subjected to rapid cooling at 5°C temperature immediately and the enzyme is extracted.

1. Separation of fungal mycelium is accomplished by filtration of the refrigerated broth.

2. The suspended particles present in the broth are removed with flocculating agents like calcium phosphate.

3. The enzyme is precipitated, in order to get high degree of purity, by using acetone or alcohol or even inorganic salts like ammonium sulphate or sodium sulphate.

4. Sometimes fractional precipitation of the enzyme is done to obtain it in purest form.

جرثومي α -Amylase:

Bacterial α -amylase is produced by Bacillus subtilis or B. amyloliquefaciens or B. licheniformis. For industrial production of bacterial α -amylase, nowadays submerged culture method is generally employed in many countries.

(a) Preparation of Inoculum:

Pure culture of any of the above-mentioned species of Bacillus is selected as inoculum. Mutants which produce 250 times greater yields than the wild strain are preferred as inoculum.

(b) Preparation of Medium:

The formulation of the production medium and control of fermentation conditions play a major role in the success of enzyme fermentations. The production medium should basically contain an energy source, a carbon source, a nitrogen source and growth requirements such as essential amino acids or vitamins. For obtaining high yields of enzyme, the production medium should also contain certain inducers like lactose.

Sometimes certain compounds like glucose present in the production medium act as repressor for certain enzymes like α-amylase. In such conditions either the concentration of glucose should be kept low or it should be fed intermittently.

The following production medium is generally employed in a submerged culture method (Table 8.5).

(c) Fermentation Process:

The type of fermenter that is used for fungal α-amylase is also used for bacterial α-amylase production. About 1000 to 30,000 gallons of production medium is taken in the fermenter and inoculated. The fermentation is continued upto 4-6 days. The pH of the medium is maintained at 7.0.

Calcium carbonate is used as a buffer for maintaining neutral pH. The temperature is maintained at 30-40°C. The production of α-amylase starts when the bacterial density reaches 10 9 -10 10 cells ml -1 . However, the enzyme production increases just before the growth rate of the microorganism decreases and spore formation begins.

(d) Harvest and Recovery:

Bacterial α-amylase is harvested and recovered by the same method that is used for the recovery of fungal α-amylase. The most active liquid enzyme preparation contains 2% amylase protein and solid preparation contains 5% amylase proteins. Flow sheet for production of α-amylase is shown in Fig. 8.4.

2. Proteases:

Proteases, second most important industrial enzymes, are produced about 500 tons per year. Proteases are primarily used in detergent, dairy, leather firms, pharmaceutical industries, the manufactured protein hydrolysates, food industry and waste processing.

Proteases are commercially produced both by fungi and bacteria based on optimum pH for their activity. They can be grouped into alkaline, neutral and acid proteases and other groups (table 8.6).

Most bacteria and some fungi excrete alkaline proteases. The most important producers of alkaline protease producers are Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. firmus, B. megaterium and B. pumilus species of Streptomyces such as S. fradiae, S. griseus and S. rectus. Some fungi like Aspergillus niger, A. sojae, A. oryzae, and A. flavus. Proteases of this type have many features of value for use as detergent enzymes. These enzymes are stable at high temperature, at alkaline range of pH (9.0 – 11.0), in association with chelating agents and perborates.

However, their stability is low in the presence of surface active agents resulting in the limited self-life. Subtilisin Carlsberg from B. licheniformis, subtilisin BPN and subtilisin NOVO from B. amyloliqui-faciens are some of the examples of this type of enzymes. These enzymes contain serine at the active site of the molecules and are not inhibited by EDTA (Ethylene diamine tetracetic acid) but are inhibited by DFP (diisopropyl fluorophosphate).

Screening for isolation of microorganisms with better production is done by using strongly basic protein media at pH 10. As most of the wild strains are with low yield and insufficient for industrial utilization, improvement of strain is being done through genetic engineering. Protein engineering has been used to develop modified Bacillus subtilopeptidase with altered amino acid sequences, corresponding changes in enzymatic properties such as substrate specificity, pH optimum and stability to bleaching agents.

Protease production occurs in shaken flasks and small fermenters or in a production fermenter of 40-100 ml capacity at 30-37°C. Production of extracellular proteases is chiefly regulated by the medium composition. The fed-batch process is generally used in order to keep down the concentration of ammonia ions and amino acids which otherwise may repress protease production. High O2 partial pressure is generally necessary for proteases titres, aeration rates are 1 V m -1 and incubation time of 48-72 hrs depending on the organism.

Proteases must be converted into particulate form before they are added to detergents since if dry enzyme powder is inhaled by production workers or users, allergic reaction may result. Enzyme is marketed in a microencapsulated form. To make a suitable encapsulated product, a wet paste of enzyme is melted at 50-70°C with hydrophobic substance such as polyethyl- eneglycol and then converted into tiny particles. These solidified spherical particles are not hazardous when added directly to the detergent. Immobilization in fibrous polymer is another development.

These proteases are excreted by Bacillus subtilis, B. cereus, B. megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae, A. sojae and Pyricularia oryzae.

Neutral proteases are relatively unstable.

Calcium and sodium chloride must be added for maximal stability. The pH range of activity is narrow and unstable to increased temperature. These are also quickly inactivated by alkaline proteases which is probably the reason for their restricted industrial application. However, they are used in leather industry and in food industry for manufacture of crackers, bread and rolls.

(ثالثا) Acid Proteases:

These include renin like proteases from fungi which are chiefly used in cheese production. These enzymes have optimum pH 2-4 and used in medicine, in the digestion of soya protein for soya sauce production and to breakdown wheat gluten in the bakery industry.

Milk coagulating enzyme in fourth chamber of 3-4 weeks old calves stomach which is being exploited in cheese production. Due to increased production of cheese and decline in the number of slaughtered calves intensive research has been carried out since 1960 to develop rennin products of microbial origin. A variety of fungi and bacteria have been isolated as producers.

It has also been examined for required characteristics.

Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia and Streptococcus are some of the bacteria that have exhibited potential of rennin production. Similarly species of Aspergillus, Candida, Coriolus, Endothia, Entomophthora, Irpex, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium and Torulopsis are also reported to produce rennin.

Mucor pusilus var. lindt for solid substrate culture, while Endothia parasitica and Mucor miehei produce this enzyme in submerged culture. Rennin produced by Endothia parastica was first rennin marketed commercially in 1967. The enzyme is an acid protease stable at pH 4.0-5.5 with a molecular weight of 34,000 – 37,500 daltons and is produced in a medium containing 3% soyameal, 1% glucose, 1% skim milk, 0.3% NaNO3, 0.05% K2HPO4,0.025%, MgSO4.7H2O, pH 6.8, at 25°C incubation temperature. At the end of 48 hrs incubation period, mycelium is separated and broth which contains enzyme is concentrated and precipitated in an evaporation process.

Similarly Mucor miehei also produces rennin in a medium containing potato starch 4%, soyameal 3%, ground barley 10%, CaCO3 0.5%, pH 5.5, 5-6 d incubation period at an incubation temperature of 40°C. Microbial renins are stable at high temperature and remain active in the curd after precipitation and subsequently causing harmful proteolysis. Therefore, complementary cDNA from calf renin is transferred into E. coli making possible the first commercial production of the calf rennin by a microorganism.

Proteases are employed in variety of fields such as:

1. Biological detergents — alkaline protease

2. Baking—dough modification/gluten weakening and flour improvement

3. Beer brewing —chill proofing of beer to remove protein haze

4. Leather bailing and tendering

5. Cheese manufacture — clotting of milk protein and promotion of ripening aspartic protease, calf chymopsin, aminopeptidase etc.

6. Meat tenderization and removal of meat from bones

7. Flavour control and production in food products

8. Waste treatment- treatment of silver from spent photographic film.

3. Pectinases :

Pectinase is an enzyme complex which contains atleast six enzymes splitting pectins at different sites of the molecule. The basic structure of pectin is α 1,4 linked galacturanic acid with upto 95% its carboxyl groups esterified with methanol. Pectinases are classified according to their attack on the point of molecule (table 8.7).

The methyl ester is split by pectinesterase and the glycosidic bonds of pectin or pectic acid, and chain are split by hydrolysis with endo- polygalacturonase or exo-polygalacturonase. Another method of splitting is transelimination by means of exo-pectate lyase or endopectate lyase or exo-and endo-pectin lyase.

Commercial production of pectinases is carried out by using Aspergillus niger or A. wentii and also species of Rhizopus either as surface or submerged fermentation in a medium containing 2% sucrose and 2% pectin in a fed batch system. The pH is adjusted to 3.0 to 4.0 and incubation temperature 37°C and incubation period upto 60-80 hrs. The enzyme is purified by separating mycelium, by filtration or centrifugation, stabilizing agents are added. The enzyme is precipitated with organic solvents and crude protein is dried and used as enzyme.

Pectinases are used primarily for clarification of fruit juices, for maceration of vegetable and fruits, for extraction of oil. By treating with pectinase, the yield of fruit juice during pressing is considerably increased. These are also used in wine classification and coffee bean fermentation.

4. Lipases :

Lipases (glycerolesterhydrolases) split fats (glycerolesters) into di-or monoglycerides and fatty acids (Fig 8.5).

These are usually extracellular. Most of lipases are produced adaptively in the presence of oils and fats. However, some organisms like Penicillium roqueforti are reported to secrete lipase constitutively and in the presence of fats its enzymes production is repressed. Species of Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Geotrichum and yeasts (Torulopsis and Candida) are reported to be good producers.

Similarly species of Pseudomonas, Achromobacter and Staphylococcus are good producers of lipases. Lipases are generally bound to the cells and hence inhibit on over production, but addition of cation such as magnesium ion liberates the lipase and leads to a higher enzyme titer in the production process.

Lipases are primarily marketed for therapeutic purpose as digestive enzymes to supplement pancreatic lipases. These enzymes are used in dairy industry. The cheese ripening process involves lipases. Lipases from Candida cylindraceae is used to hydrolyse oil in soap industry. These are useful in the synthesis of esters from acids and alcohols in non-aqueous medium. Products of interesterification catalyzed by α 1, 3 – regiospecific lipase are illustrated in Fig. 8.6.

These are also useful in improvement of fat quality by inter-esterification (exchange of one fatty acid by another in ester bond) lipases are useful in removal of fat in leather processing. These enzymes are also useful in production of flavour compounds and acceleration of ripening in dairy and meat products.

5. Cellulases :

Cellulases are the enzymes which degrade cellulose into fermentable sugars. Although cellulose is available abundantly on the earth in the form of natural plant resources like fallen leaves, flowers, fruits, broken stems, branches and waste wood, it is mixed with substances such as lignin, hemicellulose, starch, proteins etc. (Table 8.8, Fig. 8.7).

All these material are to be treated physically or chemically to breakdown cellulose into fermentable sugars. This breakdown process is called as pretreatment. The pretreatment may be done either chemically or enzymatically. In the second process cellulose enzymes are used to breakdown cellulose into simpler fermentable sugars (Table 8.9).

Most of these enzymes are excreted out by certain microorganisms which include both bacteria and fungi. Such enzymes are called extracellular enzymes. The bacteria include actinomycetes and Cellulomonas and fungi include species of Trichoderma, Penicillium, Thermoascus, Sporotrichum and Humicola. However, for commercial production of cellulases Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, P. enersonii, Aureobasidium pullulans, Sporotrichum and pulverulenium are generally employed.

Cellulase is an enzyme complex containing at least three enzymes (table 8.9 and Fig. 8.8):

1. Exo- β-1, 4 glucanase, also called as cellobiodhydrolase or C.

2. Endo-β 1, 4-glucanase also called as carboxymethyl cellulase or endocellulase (Cx).

3. β-1, 4 glucosidase or cellobiase.

Fermentation Production:

The fungus Trichoderma viride is usually used for the commercial production of cellulose. Inoculum of the fungus is raised from pure or mutant culture of Trichoderma viride GM 9414 by a process of repeated sub-culturing. Large fermenters of stainless steel are employed for fermentative production of celluloses.

The production medium consists of the following ingredients:

The fermentation is carried out at 30°C for about 140 hours. Maximum fungal growth occurs under these conditions resulting in the maximum yield of the cellulose. However, the yield of enzyme is dependent upon the cellulose concentration (Fig. 8.6). After the completion of the fermentative process the products recovered from the fermenter and the fungal mycelium is separated by filtration. Afterwards purification of the enzyme was carried out using ion exchangers.

1. Fruit juice and olive production and processing.

2. Wine and beer production and processing.

3. Malting-speedy modification of grains.

4. Textile processing-bio polishing of cellulose fibers.

6. Glucose Isomerase :

Glucose isomerase causes the isomerization of glucose to fructose. The reaction is reversible and a mixture of glucose and fructose is produced. The ratio of these products depends on the enzyme used and reaction conditions such as incubation time, pH and temperature. The enzyme has become of commercial value because price of sugar has increased as compared to that of starch.

In U.S. about 4 × 10 6 tons of isosyrup is being produced, while in Germany 10,000-12,000 tons per year. Starch can be converted to glucose by either acid hydrolysis or enzyme hydrolysis (Fig. 8.9).

The advantage of starch hydrolysis over direct sugar production (sugar beets) is that initial materials used such as wheat, corn, cassava and to some extent potatoes are non- perishable, but sugar beets are available only 100 days per year.

Glucose has 70-75%, the sweetening strength of beet sugar (sucrose) but β-D-fructose pyranose (fructose), the sweetest monosaccharide has twice the sweetening strength of sucrose. Thus, processes for the manufacture of fructose are of considerable value. Fructose can be produced biochemically from sucrose or starch by isomerase, glucose production (Fig. 8.10 a and b).

Fructose can also be produced chemically from glucose at high temperature under alkaline conditions but byproducts are formed such as psicose which cannot be metabolized in the human body. Thus chemical production of fructose is not acceptable to the food industry.

Fermentative Production:

Glucose isomerase is used in production of high fructose syrup (HFCs) or isosyrup must fulfill the following criteria:

1. Low pH optimum to avoid side reactions.

3. High temperature optima.

Some of the microorganisms producing glucose isomerase are listed in table 8.10.

Practical conversion yields are in the range of 40-50% where fructose concentration can be increased to 55% by chromatographic enrichment. Alternatively the fructose can now be separated from glucose (+) fructose mixture and the remaining glucose fraction isomerzed to produce a final combined product containing upto 80% fructose. HFCs from corn starch is cheaper than from sucrose but have same intensity of sweetening.

Consequently they have become major food ingredients particularly in North America and annual production of HFCs is now in excess of 8 × 10 9 kg. Some of the bacteria such as Escherichia intermedia, E. freudii and Aerobacter aerogenes can produce isomerase. Though they are able to produce glucose isomerase which is variant and requires arsenium for its activity, hence it cannot be used in food production.

The commercial process for production of fructose (Fig. 8.11) from glucose became feasible only when procedures for immobilization of the enzyme were developed (Fig. 8.12).

Since, glucose isomerase is formed intracellularly in most strains many commercial processes are carried out with immobilized cells or by addition of partly broken cells. Commercial production of glucose isomerase along with producing organism and industry are listed in table 8.11.


نبذة عن الكاتب

". The quality. is so great that there is no hesitation in recommending it as ideal reading for any student requiring an introduction to enzymes. . Enzymes in Industry - should command a place in any library, industrial or academic, where it will be frequently used.'
The Genetic Engineer and Biotechnologist

'Enzymes in Industry' is an excellent introduction into the field of applied enzymology for the reader who is not familiar with the subject. . offers a broad overview of the use of enzymes in industrial applications. It is up-to-date and remarkable easy to read, despite the fact that almost 50 different authors contributed. The scientist involved in enzyme work should have this book in his or her library. But it will also be of great value to the marketing expert interested in the present use of enzymes and their future in food and nonfood applications.'
أنجواندت كيمي

'This book should be available to all of those working with, or aspiring to work with, enzymes. In particular academics should use this volume as a source book to ensure that their 'new' projects will not 'reinvent the wheel'.'
Journal of Chemical Technology and Biotechnology


Industrial Applications of Thermostable Enzymes from Extremophilic Microorganisms

المؤلفون): Nasser E. Ibrahim, Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, ON N2L 3G1,, Canada Kesen Ma* Department of Biology, University of Waterloo, 200 University Avenue West, Waterloo, ON N2L 3G1, Canada

الانتماء:

Journal Name: Current Biochemical Engineering

Volume 4 , Issue 2 , 2017




Graphical Abstract:

الملخص:

Background: Enzymes are biomolecules functioning as catalysts accelerating the speed of specific reactions. Increasing global population, lifestyle trends, biofuels and chemical/pharmaceutical applications have positive impacts on global demand for new industrial enzymes. The global market of enzymes has been growing, which is estimated in 2015 to be about 3.7 billion USD with a 10% expansion.

Objectives: In this review, we discuss the thermophilic and hyperthermophilic enzymes with respect to their sources, applications, and methods for improvement. Prospective enzymes that have potential industrial applications and industries that need new candidate thermophilic enzymes will also be presented.

Results: Research, reports and online contents related to industrial enzymes are reviewed. Industrial enzymes have many applications such as detergent, food, animal feed, cosmetics, biofuel, medication, pharmaceuticals, technical use, and tools for research and development. Commercially available microbial enzymes are about 200 out of almost 4,000 enzymes known. The recent increase in the global environmental awareness requires industry with environmentally friendly conditions and as-low-aspossible energy consumption, which shed light on the benefits of using enzymes. Microorganisms are major sources for industrial enzymes, especially thermophilic and hyperthermophilic microbes. Thermostable enzymes have many desirable characteristics such as thermostability, wide range of pH tolerance and resistance to organic solvents, which make them superior for industrial applications.

Conclusion: Thermophilic and hyperthermophilic enzymes represent a superior source for industrial applications. More efforts are needed for increasing the implementation of thermophilic and hyperthermophilic enzymes in industries, and screening for new enzymes from different sources and creating new methods for harnessing these enzymes for more industrial applications.

Current Biochemical Engineering

عنوان:Industrial Applications of Thermostable Enzymes from Extremophilic Microorganisms

الصوت: 4 مشكلة: 2

المؤلفون):Nasser E. Ibrahim and Kesen Ma*

الانتماء:Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, ON N2L 3G1,, Department of Biology, University of Waterloo, 200 University Avenue West, Waterloo, ON N2L 3G1

الملخص:Background: Enzymes are biomolecules functioning as catalysts accelerating the speed of specific reactions. Increasing global population, lifestyle trends, biofuels and chemical/pharmaceutical applications have positive impacts on global demand for new industrial enzymes. The global market of enzymes has been growing, which is estimated in 2015 to be about 3.7 billion USD with a 10% expansion.

Objectives: In this review, we discuss the thermophilic and hyperthermophilic enzymes with respect to their sources, applications, and methods for improvement. Prospective enzymes that have potential industrial applications and industries that need new candidate thermophilic enzymes will also be presented.

Results: Research, reports and online contents related to industrial enzymes are reviewed. Industrial enzymes have many applications such as detergent, food, animal feed, cosmetics, biofuel, medication, pharmaceuticals, technical use, and tools for research and development. Commercially available microbial enzymes are about 200 out of almost 4,000 enzymes known. The recent increase in the global environmental awareness requires industry with environmentally friendly conditions and as-low-aspossible energy consumption, which shed light on the benefits of using enzymes. Microorganisms are major sources for industrial enzymes, especially thermophilic and hyperthermophilic microbes. Thermostable enzymes have many desirable characteristics such as thermostability, wide range of pH tolerance and resistance to organic solvents, which make them superior for industrial applications.

Conclusion: Thermophilic and hyperthermophilic enzymes represent a superior source for industrial applications. More efforts are needed for increasing the implementation of thermophilic and hyperthermophilic enzymes in industries, and screening for new enzymes from different sources and creating new methods for harnessing these enzymes for more industrial applications.


Biotechnological and Industrial Applications of Enzymes Produced by Extremophilic Bacteria. A Mini Review

How to cite: Dumorné, K. Biotechnological and Industrial Applications of Enzymes Produced by Extremophilic Bacteria. A Mini Review. المطبوعات المسبقة 2018, 2018010198 (doi: 10.20944/preprints201801.0198.v1). Dumorné, K. Biotechnological and Industrial Applications of Enzymes Produced by Extremophilic Bacteria. A Mini Review. Preprints 2018, 2018010198 (doi: 10.20944/preprints201801.0198.v1). Copy

Cite as:

Dumorné, K. Biotechnological and Industrial Applications of Enzymes Produced by Extremophilic Bacteria. A Mini Review. المطبوعات المسبقة 2018, 2018010198 (doi: 10.20944/preprints201801.0198.v1). Dumorné, K. Biotechnological and Industrial Applications of Enzymes Produced by Extremophilic Bacteria. A Mini Review. Preprints 2018, 2018010198 (doi: 10.20944/preprints201801.0198.v1). Copy


Literature about industrial enzyme application - Biology

ملخص المقال:

Enzymes- An Introduction

Enzymes are amino acid polymers whose structures derive their definition from the genetic code stored in the DNA that determines the amino acid sequence of a protein, which defines the primary structure of the protein. This primary structure aids in directing the protein self-assemble into three structures namely secondary, tertiary, and quaternary, which are responsible for the three-dimensional, active protein conformation. This self- assembly process is called "protein folding" and brings all the amino acids of the protein polymer together so that a catalytic active center is formed.

Enzymes function as stereospecific catalysts to form the cell system all the while acting as mediators for all chemical reactions occurring in the living system. Enzymes along with other proteins aid in repair, duplication, and information expression in a cell's DNA.

Enzymes hydrolyze proteins and other polysaccharides and also serve as biocatalysts in many chemical reactions. Enzymes have been of primary importance since the nineteenth century serving as powerful biocatalysts in cell metabolic pathways.

Enzymes in Systems Biology

Metabolic engineering analyzes protein overexpression or the up and down regulation of proteins, which achieves catalytic activity to enhance the substrate flow to form the desired end product. Metabolic pathways in microorganisms help in identifying a weak or missing link between the substrate and the end product and could potentially lead to genes insertion, which generates an enzyme pathway or a missing enzyme, when expressed.

A good example is the xylose kinase gene insertion into yeast or into E.coli to generate organisms that are capable of fermenting glucose and xylose to ethanol. This process increases the ethanol yield from crops, grass, or trees by 50 percent.

Alternatively, substrate carbon can be directed to the specific product by eliminating or blocking metabolic pathways, which direct certain substrates to other products. A good example is a bacterium, which produces two organic acid types, namely acetate and lactate-- where only one is the desired end product. Knocking out acetate pathway leads to more lactate or vice versa.

Enzyme progress in biotechnology has resulted in gene shuffling, which achieved success in random. Recombinant techniques were used to randomly cut and recombined genes. Under specific growth conditions, microbial cells that contained the shuffled genes were selected, propagated, and then altered. This cycle is repeated until the desired product is obtained. Enzymes and gene shuffling, under the direction of a scientist, have resulted in an evolution with potential economic advantages hence the process became to be known as directe evolution.

Enzymes and Industrial Applications

Industrial enzymes are derived from microorganisms. Before the concept of molecular biology evolved, the DNA of microorganisms was altered randomly by treating the microbes with mutagens or radiation. This process hoped to isolate survivors with enhanced propensity to produce the desired end product. One such example includes: the

Rut C30 strain of the fungi Trichoderma reesei was generated in this manner by cellulose hydrolysis to produce cellulases. Once molecular biology took shape, microorganisms were altered genetically to produce proteins. Also, enzymes with special activities were obtained either by biocatalysis combination or site-directed mutagenesis.

In in vivo process, enzymes catalyze a series of reactions predominantly in an aqueous environment. Reversibility is exhibited in major portions of the reactions. reactions are primarily directed to the specific products for industrial applications by growing microorganisms so that the environmental conditions and metabolic pathways direct intermediates flux to the desired end product. This is either achieved by a gene modification in the organism to add an enzyme pathway or a missing enzyme or by enhancing the activity of an enzyme present in the microbe.

In in vitro process, the catalysis of soluble enzymes occurs in both aqueous and non-aqueous environments for important industrial reactions. Industrial enzymes are used either in an immobilized or soluble form. In heterogeneous reactions, soluble enzymes are used in a batch reactor. Example include: lipases and proteases in laundry detergents-- where laundry acts as a solid matrix-- and in cheese making--where colloidal proteins are modified by proteases to form a solid. In homogenous reactions, immobilized enzymes are used. Example includes the glucose isomerization to fructose.

Enzymes, especially immobilized enzymes, have achieved a 40 million worldwide sale till date. Immobilized enzymes that contain fumarase, penicillin acylase, and β-galactosidase

About Author / Additional Info:

Important Disclaimer: All articles on this website are for general information only and is not a professional or experts advice. We do not own any responsibility for correctness or authenticity of the information presented in this article, or any loss or injury resulting from it. We do not endorse these articles, we are neither affiliated with the authors of these articles nor responsible for their content. Please see our disclaimer section for complete terms.


Industrial Applications of Thermostable Enzymes from Extremophilic Microorganisms

المؤلفون): Nasser E. Ibrahim, Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, ON N2L 3G1,, Canada Kesen Ma* Department of Biology, University of Waterloo, 200 University Avenue West, Waterloo, ON N2L 3G1, Canada

الانتماء:

Journal Name: Current Biochemical Engineering

Volume 4 , Issue 2 , 2017




Graphical Abstract:

الملخص:

Background: Enzymes are biomolecules functioning as catalysts accelerating the speed of specific reactions. Increasing global population, lifestyle trends, biofuels and chemical/pharmaceutical applications have positive impacts on global demand for new industrial enzymes. The global market of enzymes has been growing, which is estimated in 2015 to be about 3.7 billion USD with a 10% expansion.

Objectives: In this review, we discuss the thermophilic and hyperthermophilic enzymes with respect to their sources, applications, and methods for improvement. Prospective enzymes that have potential industrial applications and industries that need new candidate thermophilic enzymes will also be presented.

Results: Research, reports and online contents related to industrial enzymes are reviewed. Industrial enzymes have many applications such as detergent, food, animal feed, cosmetics, biofuel, medication, pharmaceuticals, technical use, and tools for research and development. Commercially available microbial enzymes are about 200 out of almost 4,000 enzymes known. The recent increase in the global environmental awareness requires industry with environmentally friendly conditions and as-low-aspossible energy consumption, which shed light on the benefits of using enzymes. Microorganisms are major sources for industrial enzymes, especially thermophilic and hyperthermophilic microbes. Thermostable enzymes have many desirable characteristics such as thermostability, wide range of pH tolerance and resistance to organic solvents, which make them superior for industrial applications.

Conclusion: Thermophilic and hyperthermophilic enzymes represent a superior source for industrial applications. More efforts are needed for increasing the implementation of thermophilic and hyperthermophilic enzymes in industries, and screening for new enzymes from different sources and creating new methods for harnessing these enzymes for more industrial applications.

Current Biochemical Engineering

عنوان:Industrial Applications of Thermostable Enzymes from Extremophilic Microorganisms

الصوت: 4 مشكلة: 2

المؤلفون):Nasser E. Ibrahim and Kesen Ma*

الانتماء:Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, ON N2L 3G1,, Department of Biology, University of Waterloo, 200 University Avenue West, Waterloo, ON N2L 3G1

الملخص:Background: Enzymes are biomolecules functioning as catalysts accelerating the speed of specific reactions. Increasing global population, lifestyle trends, biofuels and chemical/pharmaceutical applications have positive impacts on global demand for new industrial enzymes. The global market of enzymes has been growing, which is estimated in 2015 to be about 3.7 billion USD with a 10% expansion.

Objectives: In this review, we discuss the thermophilic and hyperthermophilic enzymes with respect to their sources, applications, and methods for improvement. Prospective enzymes that have potential industrial applications and industries that need new candidate thermophilic enzymes will also be presented.

Results: Research, reports and online contents related to industrial enzymes are reviewed. Industrial enzymes have many applications such as detergent, food, animal feed, cosmetics, biofuel, medication, pharmaceuticals, technical use, and tools for research and development. Commercially available microbial enzymes are about 200 out of almost 4,000 enzymes known. The recent increase in the global environmental awareness requires industry with environmentally friendly conditions and as-low-aspossible energy consumption, which shed light on the benefits of using enzymes. Microorganisms are major sources for industrial enzymes, especially thermophilic and hyperthermophilic microbes. Thermostable enzymes have many desirable characteristics such as thermostability, wide range of pH tolerance and resistance to organic solvents, which make them superior for industrial applications.

Conclusion: Thermophilic and hyperthermophilic enzymes represent a superior source for industrial applications. More efforts are needed for increasing the implementation of thermophilic and hyperthermophilic enzymes in industries, and screening for new enzymes from different sources and creating new methods for harnessing these enzymes for more industrial applications.


Literature about industrial enzyme application - Biology

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يجوز إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


شاهد الفيديو: Hoe teken je een Oor, stap voor stap (قد 2022).


تعليقات:

  1. Shaktiramar

    يا هلا ، يا هلا ... انتظر

  2. Talo

    حررني منه.

  3. Cecilius

    رائع جدًا للذهاب إلى مدونة جيدة وقراءة حقيقية

  4. Mazujind

    إنه لأمر مؤسف أنني لا أستطيع التحدث الآن - لقد تأخرت عن الاجتماع. لكنني سأكون حرة - سأكتب بالتأكيد ما أعتقد.

  5. Evelyn

    أنت لست الخبير ، عرضا؟



اكتب رسالة