معلومة

هل يتحلل الحمض النووي النووي من أي وقت مضى؟

هل يتحلل الحمض النووي النووي من أي وقت مضى؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

السمة المميزة لتفتيت الحمض النووي المبرمج هي هضم الحمض النووي في النوكليوسومات الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، في التجربة التالية التي حاولت عزل مكونات nucleosome ، قام nuclease micrococcal فقط بشق الحمض النووي الرابط وليس DNA nucleosomal.

لقد حاولت البحث في الإنترنت ولكن لم أجد إجابة واضحة لسؤالي. هل يتحلل الحمض النووي النووي من أي وقت مضى؟ هل هناك نوكليازات تحط منه ، وإذا كانت موجودة ، فهل هي شائعة؟ إذا لم يتحلل DNA nucleosomal ، فما الذي يحميه؟ بروتينات هيستون؟


سؤال جيد! النيوكليوسوم هو هيكل مستقر تمامًا بسبب عوامل الجذب الكهروستاتيكية بين مجموعة الفوسفات من الحمض النووي والليسين أو الأرجينين من هيستون أوكتامر1. في الواقع ، من المعروف أن كلًا من الهيستون والحمض النووي يحميان بعضهما البعض من التدهور: يحمي الهيستون الحمض النووي من بعض أنواع التلف.2 والحمض النووي يحمي بروتين الهيستون من تحلل البروتين3. أيضًا ، يتم تعديل بروتين هيستون كلما كان هناك ضرر للحمض النووي النووي ، بحيث يمكن تنشيط آلية إصلاح الحمض النووي4. وبالتالي ، فإن النواة ليست مستقرة من الناحية الهيكلية فحسب ، بل تحاول أيضًا الحفاظ على استقرارها من خلال مكوناتها التي تحمي بعضها البعض.

مصدر

لقد تم نقل هذا الاستقرار أيضًا إلى مستوى جديد تمامًا. في ورقة بحثية ، توقع العلماء أن سبب اكتشاف الحمض النووي منذ آلاف السنين ، في شكل سليم ، يرجع إلى استقرار الجسيم النووي.5. لقد توقعوا أن الحمض النووي النووي يمكن أن يظل قابلاً للقراءة حتى لملايين السنين ، لأن الوقت الذي تبدأ فيه الهيستونات في التدهور هو أيضًا الوقت الذي يتحلل فيه البروتياز والنوكلياز ، مما يترك فرصًا قليلة جدًا لتحلل الحمض النووي.

لكن التحلل النووي ليس مستحيلاً. في بحث ، خلص العلماء إلى أن إنزيمات Caspase Activated DNase (CAD) أو عامل تجزئة الحمض النووي 40 (DFF)40) ، تسمى معًا CAD / DFF40، مطلوبة بشكل غير مباشر لتدهور النيوكليوسوم6. انظر هذه الفقرة (لقد قمت بلصق النقاط الرئيسية فقط):

لقد أبلغنا هنا أنه استجابة لإشارات موت الخلايا المبرمج من مستقبلات الموت (CD95 وعامل نخر الورم - $ alpha $) أو منبه الميتوكوندريا (staurosporine) ، فإن الهيستونات النووية النواة H2A و H2B و H3 و H4 تنفصل عن الحمض النووي أثناء موت الخلايا المبرمج في خلايا Jurkat و HLa وبالتالي يمكن اكتشافها في محلول الخلية المحضر باستخدام منظف غير أيوني. يرتبط توقيت إطلاق الهيستون هذا من الحمض النووي بشكل جيد مع تطور موت الخلايا المبرمج ... مجتمعة ، توضح هذه البيانات أن CAD / DFF40 يعمل بشكل غير مباشر في التوسط في تدمير النواة أثناء موت الخلايا المبرمج ... في هذه الدراسة ، وجدنا أن الهيستونات النواة منفصلة عن الكروماتين في الخلايا المبرمج ، ولكن هذا ليس مجرد منتج ثانوي لتفتيت الحمض النووي. يرتبط هذا الحدث بشكل غير مباشر بـ CAD / DFF40 بمعنى أن CAD / DFF40 مطلوب ولكنه غير كاف لإطلاق هيستون موت الخلايا المبرمج.

وهكذا ، على الرغم من أنها الورقة الوحيدة التي يمكن أن أجدها ، إلا أن الحمض النووي النووي يمكن أن يتحلل أيضًا بنفس الطريقة التي يتحلل بها الحمض النووي للرابط إذا كانت كمية أكبر من CAD / DFF40 موجود لتقليله.

مراجع:

  1. هيكل هيستون واستقرار النواة ؛ ليوناردو مارينو راميريز ، ومارسيل جي كان ، وبنجامين إيه شوميكر ، وديفيد لاندسمان
  2. يحمي بروتين الهيستون النووي الحمض النووي من التلف الناتج عن الحديد ؛ هيلين يو رايت ، ويسلي جي ميلر ، وروبرت بي هيبل
  3. يحمي الأكتين والحمض النووي الهيستونات من التحلل بفعل البروتياز البكتيري لكنهما يثبطان نشاطهما المضاد للميكروبات ؛ أساف سول ، ويانيف سكفيرسكي ، وإدنا بلوتنيك ، وجلعاد باخراش ، وأندراس مولراد
  4. هيستون - ويكيبيديا
  5. تدهور الحمض النووي القديم ؛ تسفي كيلمان ، لوري موران
  6. إطلاق الهستونات من النيوكليوسومات ؛ دونغتشنغ وو ، وأليستير إنغرام ، وجيل إتش لاهتي ، وبري مازا ، وخوسيه غرينيه ، وأنيل كابور ، وليكي ليو ، وفنسنت جيه كيد ، ودامو تانغ

يتم الحفاظ على Centromeres عن طريق ربط CENP-A بالحمض النووي وتوجيه انتقال النواة المعتمد على مرساة الأرجينين

يعتمد الحفاظ على هوية السنترومير على استمرار العلامة اللاجينية التي يوفرها متغير هيستون H3 ، بروتين السنترومير A (CENP-A) ، لكن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء استقرارها الملحوظ تظل غير واضحة. هنا ، نحدد مساهمات كل مجال من مجالات ربط النوكليوسوم الثلاثة المرشحة لـ CENP-A (اثنان في CENP-C وواحد في CENP-N) لاستقرار CENP-A باستخدام استبدال الجينات وتدهور البروتين السريع. والمثير للدهشة أن المجال الأكثر حفظًا ، وهو نموذج CENP-C ، يمكن الاستغناء عنه. بدلاً من ذلك ، يتم منح الاستقرار من خلال المجال المركزي غير المطوي لـ CENP-C والمجال الطرفي N المطوي لـ CENP-N الذي يصبح صلبًا بمقدار 1000 مرة عند التهجين المتقاطع لـ CENP-A والحمض النووي النووي المجاور له. يؤدي تعطيل `` مرساة أرجينين '' في CENP-C للرقعة الحمضية النووية إلى تعطيل الانتقال الهيكلي للنواة CENP-A ويزيل نيوكليوسومات CENP-A من السنتروميرات. يتطلب الاحتفاظ بالنيوكليوسوم CENP-A في السنتروميرات معقدًا نواة مركزيًا مركزيًا حيث يقوم CENP-C بتثبيت التشكل النووي المستقر و CENP-N يربط CENP-A بالحمض النووي.

بيان تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

الأرقام

الشكل 1. القرص المضغوط CENP-C هو ...

الشكل 1. القرص المضغوط CENP-C هو المجال الوحيد المرتبط بالنيوكليوسوم لـ CENP-C المطلوب للاحتفاظ بـ ...

الشكل 2. مرساة أرجينين CENP-C ...

الشكل 2. مرساة أرجينين للقرص المضغوط CENP-C أمر بالغ الأهمية لبنية النواة CENP-A ...

الشكل 3. مرساة أرجينين CENP-C ...

الشكل 3. مرساة الأرجينين للقرص المضغوط CENP-C مطلوب لاستقرار النواة CENP-A عند ...

الشكل 4. جسور CENP-N NT المتقاطعة CENP-A إلى ...

الشكل 4. جسور تقاطع CENP-N NT مع CENP-A إلى DNA.

( أ ) كوماسي SDS الملون الأزرق- PAGE من التنقية المشتركة ...

الشكل 5. يخضع CENP-N NT لاستقرار عالمي ...

الشكل 5. يخضع CENP-N NT للاستقرار العالمي عند الارتباط بـ CENP-A nucleosome.

الشكل 6. القرص المضغوط CENP-C و CENP-N NT ...

الشكل 6. يرتبط القرص المضغوط CENP-C و CENP-N NT في نفس الوقت بنفس CENP-A NCP و ...

الشكل 7. يتعاون CENP-C و CENP-N من أجل ...

الشكل 7. يتعاون CENP-C و CENP-N للحفاظ على نيوكليوسومات CENP-A في السنتروميرات.

الشكل 8. نموذج الأساس المادي ...

الشكل 8. نموذج للأساس المادي لاستقرار نيوكليوسومات CENP-A داخل ...


ملخص المؤلف

الهيكل الثماني للنيوكليوسومات حقيقية النواة مقبول عالميًا كوحدة أساسية للكروماتين. هذا هو الحال بالتأكيد بالنسبة للجزء الأكبر من النيوكليوسومات ، ومع ذلك ، لم تكن هناك تقارير عن التركيب في الجسم الحي للنيوكليوسومات المرتبطة بالوسط. على الرغم من أن السنتروميرات تشكل جزءًا صغيرًا فقط من المشهد الجينومي ، فإن دورها في فصل الكروموسومات أثناء الانقسام الفتيلي ضروري للحفاظ على السلامة الجينية. أبلغنا عن توصيف الكروماتين المركزي من ذبابة الفاكهة الخلايا ، باستخدام التحليلات المجهرية البيوكيميائية والميكروسكوبية الإلكترونية والقوة الذرية التفصيلية. من المثير للدهشة أننا وجدنا أنه في تناقض صارخ مع الكروماتين السائب ، فإن النيوكليوسومات المركزية هي رباعيات نمطية غير متجانسة مستقرة في الجسم الحي ، مع نسخة واحدة من CenH3 (متغير H3 الخاص بالوسط) ، و H2A ، و H2B ، و H4 لكل منها ، وتلف دورة كاملة من الحمض النووي. في الطور البيني (مرحلة نمو الخلية في دورة الخلية). ينتج عن هذا جزيئات نوكليوزوم التي يبلغ ارتفاعها نصف ارتفاع النيوكليوسومات السائبة. يمكن أن تساعد هذه النتائج غير المتوقعة في تفسير السلوك الديناميكي للنيوكليوسومات المحتوية على CenH3 ، حيث يتم ترسيبها بشكل مختلط ولكن يتم تحويلها في مناطق غير مركزية. إن عرضنا لوجود نصف نيوكليوسومات مستقرة في السنتروميرات يشير إلى آلية جديدة للحفاظ على هوية السنترومير.

الاقتباس: Dalal Y، Wang H، Lindsay S، Henikoff S (2007) Tetrameric Structure of Centromeric Nucleosomes in Interphase ذبابة الفاكهة الخلايا. بلوس بيول 5 (8): e218. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050218

محرر أكاديمي: جيم كادوناغا ، جامعة كاليفورنيا سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية

تم الاستلام: 24 أبريل 2007 وافقت: 12 يونيو 2007 نشرت: 31 يوليو 2007

حقوق النشر: © 2007 دلال وآخرون. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر.

التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم YD من خلال جائزة (إلى SH) من National Science Foundation (DBI 0234960).

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الاختصارات: AFM ، الفحص المجهري للقوة الذرية قبل الميلاد ، الكروماتين السائب CenH3 ، هيستون H3 DMS الخاص بالسنترومير ، ثنائي ميثيل سوبريميدات IP ، MNase المناعي المناعي ، نوكلياز المكورات الدقيقة


علم الوراثة الوراثي للنيوكليوسوم

تشتهر الهيستونات بالبروتينات المعمارية التي تحزم الحمض النووي للكائنات حقيقية النواة ، وتشكل نوى ثماني النواة يلتف حولها اللولب المزدوج بإحكام. على الرغم من أن الهستونات كان يُنظر إليها تقليديًا على أنها بروتينات سقالة تتطور ببطء وتفتقر إلى التنويع وراء تعديلات الذيل الوفيرة ، فقد كشفت الدراسات الحديثة أن الهستونات المتغيرة قد تطورت لوظائف متنوعة. تنوعت متغيرات H2A و H3 لتولي أدوارًا في إسكات الجينات والتعبير الجيني والوظيفة المركزية. يتناقض هذا التنويع في متغيرات الهيستون و "المنحرفات" مع تصور الهيستونات كأعضاء رتيبة من عائلات متعددة الجينات تقوم بتجميع الجينوم وضغطه بشكل عشوائي. كيف تطورت هذه الوظائف المتنوعة من أشكال الأسلاف يمكن معالجتها من خلال تطبيق أدوات النشوء والتطور على بيانات التسلسل الوفيرة بشكل متزايد.


Denisovans: قريب بشري آخر

وجد العلماء أيضًا الحمض النووي من مجموعة أخرى منقرضة من أشباه البشر: إنسان الدينيسوفان. البقايا الوحيدة من الأنواع التي تم العثور عليها حتى الآن هي جزء واحد من كتيبة (عظم الإصبع) واثنين من الأسنان ، تعود جميعها إلى حوالي 40000 عام (Reich 2010). هذا النوع هو أول أحفوري من أشباه البشر تم تحديده على أنه نوع جديد يعتمد على الحمض النووي الخاص به وحده. دينيسوفان هم أقارب لكل من البشر المعاصرين والنياندرتال ، ومن المحتمل أن يكونوا قد تباعدوا عن هذه الأنساب منذ حوالي 300000 إلى 400000 عام. قد تتساءل: إذا كان لدينا الحمض النووي للدينيسوفان ، فلماذا لا يمكننا مقارنتها بالإنسان الحديث مثل البشر البدائيين؟ لماذا لا يتعلق هذا المقال بهم أيضًا؟ الجواب ببساطة أنه ليس لدينا ما يكفي من الحمض النووي لإجراء مقارنة. مجموعة عينات الدينيسوفان الثلاثة التي تم العثور عليها حتى الآن هي مجموعة بيانات صغيرة جدًا من الناحية الإحصائية لاشتقاق أي مقارنات ذات مغزى. حتى نعثر على المزيد من مواد الدينيسوفان ، لا يمكننا البدء في فهم جينومها الكامل بالطريقة التي يمكننا بها دراسة إنسان نياندرتال.

شارك إنسان نياندرتال والإنسان الحديث الموائل في أوروبا وآسيا

يمكننا دراسة الحمض النووي للإنسان البدائي والحديث لنرى ما إذا كان قد تزاوج مع الإنسان الحديث

يمكننا دراسة الحمض النووي لإنسان نياندرتال لأن لدينا حجم عينة كبير بما يكفي لإنسان نياندرتال (عدد أفراد إنسان نياندرتال) لمقارنته بالبشر


نقاش

تم استخدام أجسام مضادة مختلفة ضد بروتينات الغلاف النووي في توصيف مفصل لموت الخلايا المبرمج النووي في خلايا BRL المعالجة بالستيروسبورين. اقترحت المقارنة الزوجية للخلايا الفردية ذات العلامات المزدوجة بواسطة الفحص المجهري الفلوري أن البروتينات من الغلاف النووي اختفت بترتيب تسلسلي. تم تأكيد ذلك من خلال تحليل اللطخة الغربية لبروتينات الغلاف النووي من مزارع الخلايا المبرمج. تمت مقارنة إزالة البروتينات من الغلاف النووي في خلايا BRL الأبوطوزية مع السمات المميزة الأخرى لموت الخلايا المبرمج (درجة تكثيف الكروماتين ، وتدهور الحمض النووي وتكتل NPC) وتم تجميعها في نموذج (الشكل 9). يمكن التمييز بوضوح بين ثلاث مراحل مختلفة من تطور موت الخلايا المبرمج: المرحلة الأولى ، كروماتين مكثف بشكل معتدل محاط بطرف نووي ناعم من المرحلة الثانية ، بقع مدمجة من الكروماتين المكثف تنهار مقابل محيط نووي ناعم ، المرحلة الثالثة ، أجسام كروماتين مستديرة مدمجة تحيط بها محيط نووي على شكل عنب . كان تكثيف الكروماتين حدثًا مبكرًا في نواة خلية BRL (المرحلة الأولى). بدأ تجزئة الحمض النووي كما تم الحكم عليه بواسطة اختبار TUNEL ، في وقت لاحق (المرحلة الثانية). ومن المثير للاهتمام ، أن اختفاء POM121 و RanBP2 بدأ في المرحلة الأولى وكان قد اكتمل إلى حد ما في المرحلة الثانية. من الواضح أن تحلل هذين النيوكليوبورين قد سبق تدهور NUP153 و lamin B ، والذي بدأ في المرحلة الثانية واستمر تدريجياً خلال المرحلة الثالثة. على النقيض من ذلك ، بقي p62 في المرحلة الثالثة ، مما سمح باكتشاف تجمع المسام ، وهي سمة مميزة أخرى لموت الخلايا المبرمج (Buendia et al. ، 1999 Falcieri et al. ، 1994). تطورت تجمعات المسام تدريجياً ، وبدأت بشكل واضح بعد القضاء على POM121 و RanBP2. يبدو أن تجمع المسام مرتبط باختفاء NUP153 و lamin B ، وأصبح أكثر وضوحًا مع تغيرات الشكل المحيطي النووي.

على الرغم من أنه يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن برنامج الاستماتة قد يختلف اعتمادًا على نوع الخلية وطريقة البدء ، فإن الترتيب التسلسلي لإزالة البروتينات من الغلاف النووي المذكور هنا يتوافق مع المنشورات السابقة. على سبيل المثال ، لقد ثبت أن تحلل lamin B و Lap2 و NUP153 سبق التحلل البروتيني لـ p62 و LBR و gp210 (Buendia et al. ، 1999). أظهرت دراسة أخرى (Gotzmann et al. ، 2000) أن تحلل اللامين B يسبق تدهور عقار إمين. في كلا التقريرين المذكورين أعلاه ، تم تدهور lamin B إلى حد كبير في الخلايا التي تظهر درجة عالية من تكثيف الكروماتين ، بما يتوافق مع المراحل من الثاني إلى الثالث في تحقيقنا. أبلغ فاليرو ولازيبنيك عن انخفاض في المناعة في الخلايا المبرمج بسبب عدم إمكانية الوصول أو تعديل الحاتمة المعترف بها بواسطة الأجسام المضادة mAb414 (Faleiro and Lazebnik ، 2000). لم يكن هذا هو الحال في دراستنا ، حيث كانت البيانات من الفلورة المناعية والنشاف الغربي مرتبطة جيدًا (الشكل 5 ، الشكل 7).

نظرًا لأنه يُعتقد أن NPCs مرتبطة بالصفيحة النووية (Daigle ، 2001 Dwyer and Blobel ، 1976) ، فمن المغري التكهن بأن تجمع المسام النووية وفقدان سلامة الغشاء يعتمد على اضطراب الصفيحة النووية. في الواقع ، كان تجميع NPC أحد أكثر السمات المدهشة في أجنة ذبابة الفاكهة التي تفتقر إلى اللامينات من النوع B (Lenz-Bohme et al. ، 1997) والفئران التي تفتقر إلى نوى lamin A معروضة مع مظاريف نووية متقطعة مضطربة (Sullivan et al. ، 1999) . تم الإبلاغ عن أن التخلص من الخلايا المبرمج للامين B مرتبط بظهور الانقطاعات في الغلاف النووي لخلايا الورم الكبدي DU249 الدجاج (Duband-Goulet et al. ، 1998).

تقدم هذه الدراسة ، لأول مرة ، البيانات التي تربط القضاء المبرمج لبروتين غشاء المسام المتكامل POM121 مع بروتينات NE الأخرى وغيرها من السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج. من المثير للدهشة أن POM121 مع RanBP2 يبدو أنهما أول بروتينات NPC التي تدهورت. في الوقت الحالي ، لم نحدد الكاسبيز المسؤول عن تدهور POM121 ولم نتمكن من اكتشاف أي جزء (أجزاء) محللة للبروتين. يحتوي الجزء C الطرفي المكشوف السيتوبلازمي من POM121 على اثنين من رباعي الببتيدات D 146 PRD و D 528 KTD ، والتي يمكن أن تعمل كمواقع محتملة لتحلل الكاسبيز (كوهين ، 1997) ، على الرغم من أن هذا لا يزال يتعين تحليله تجريبيًا.

يمكن تفسير الترتيب التسلسلي للتخلص من بروتينات NE التي لوحظت بطريقتين مختلفتين. إذا تم تدهور بروتينات NE ببساطة عن طريق مجموعة مشتركة من كاسبيسات المستجيب المصب ، يتوقع المرء أن يكون ترتيب التدهور مقيدًا بإمكانية الوصول. يبدو أنه من الممكن أن تستمر عملية موت الخلايا المبرمج في اتجاه الجاذبية كمدرج من الكاسبيسات المنشطة بدءًا من السيتوبلازم وتشق طريقها إلى النواة. في مثل هذا السيناريو ، ستتحلل البروتينات التي يمكن الوصول إليها من الجانب السيتوبلازمي من NPC أولاً. هذا صحيح بالنسبة لكل من RanBP2 ، الموجود على الألياف السيتوبلازمية (Yokoyama et al. ، 1995) و POM121 ، الذي ثبت أنه يمكن الوصول إلى الجزء C الطرفي للأجسام المضادة في خلايا BRL المعالجة بالديجيتونين (Soderqvist and Hallberg ، 1994). في آلية الجاذبية المركزية ، سيتعين على الكاسبيسات المنشطة أولاً أن تدخل النواة قبل الوصول إلى NUP153 ولامين B على الجانب النووي لشرح تأخر تدهورها. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج لا يفسر المقاومة ضد التدهور التي أظهرها p62 و gp210 والإخراج حتى في وقت متأخر من موت الخلايا المبرمج (هذه الدراسة) (Buendia et al. ، 1999 Gotzmann et al. ، 2000). علاوة على ذلك ، تُظهر دراسة فائقة التركيب أن مجمعات المسام العنقودية في موت الخلايا المبرمج النووي المتأخر تحافظ بشكل أساسي على هيكلها العام وكثافتها (Falcieri et al. ، 1994) ، مما يشير إلى أن معظم بروتينات NPC لا تزال سليمة. التفسير الأكثر ترجيحًا للتدهور المتسلسل الذي لوحظ في دراستنا هو أنه في البداية فقط مجموعة انتقائية من الأهداف الإستراتيجية يتم مهاجمتها بواسطة البروتياز المنبع. قد يمهد هذا الهجوم الأولي الطريق لمزيد من التدمير الجوهري في مراحل لاحقة ، وربما يسهل ذلك بفقدان وظيفة المسام وزيادة النفاذية. يُعتقد أن الجزء C- الطرف من POM121 يقع في منطقة التكلم المركزية التي تفصل القنوات الطرفية الأصغر لـ NPC التي يُعتقد أنها تسمح بانتشار البروتينات الأصغر بين المقصورات السيتوبلازمية والنووية (Hinshaw et al. ، 1992). وبالتالي ، من المتوقع أن يؤدي القضاء على POM121 إلى تسهيل زيادة الانتشار. يُعتقد أن بروتينات غشاء المسام تعمل في تكوين المسام وترسيخ NUPs المحيطية ، ويُعتقد أنها مهمة لاستقرار NPC. وبالتالي ، قد يؤدي التدهور الأولي لـ POM121 في موت الخلايا المبرمج إلى زعزعة استقرار NPC وربما يسمح بالدخول النووي لكاسبيز المستجيب والنوكليازات. سيكون النموذج الأخير متسقًا مع دراسة حديثة ، تُظهر أن تعطيل الحاجز الخلوي النووي يعتمد على caspase-9 ويسبق تنشيط caspase-3 (Faleiro and Lazebnik ، 2000).

محددات الفرز لـ gp210 ، بروتين غشاء مسامي فقاري آخر ، تم تحديد موقعه في جزء الغشاء الفردي الخاص به وإلى ذيله الطرفي C المكون من 58 حامضًا أمينيًا (Wozniak and Blobel ، 1992) ، مما يشير إلى أن أيًا من هذين المجالين أو كلاهما قادر على تتفاعل مع البروتينات المعقدة المسامية الأخرى (مثل POM121) ، كما تم اقتراحه (Hallberg et al. ، 1993). في POM121 ، تبين أن جزءًا (الأحماض الأمينية 129-618) من المجال الطرفي C المكشوف السيتوبلازمي مسؤول عن استهداف المسام النووية (Söderqvist et al. ، 1997). نوضح هنا أن gp210 ظل مرتبطًا بالمسام النووية للخلايا الأبوطوزية عندما تم التخلص من POM121. تتوافق بياناتنا مع دراسة سابقة (Buendia et al. ، 1999) تُظهر أن gp210 يتدهور في خطوة تالية لتدهور NUP153 و lamin B في موت الخلايا المبرمج. تشير بياناتنا أيضًا إلى أن POM121 غير مطلوب للحفاظ على gp210 في غشاء المسام. بطبيعة الحال ، لا يستبعد هذا التفاعل (التفاعلات) بين هذين البروتينين في حالات أخرى (على سبيل المثال أثناء تكوين المسام).

في هذا البحث ، أظهرنا أن POM121-GFP المفرط التعبير و POM121 الداخلي يتحللان بشكل متزامن ، وأن التحلل البروتيني POM121 يعتمد على كاسباس ويبدو أنه ظاهرة عامة في موت الخلايا المبرمج. علاوة على ذلك ، لقد أظهرنا أن POM121 كان من أوائل البروتينات التي تم التخلص منها في NE ، والتي حدثت قبل العديد من العلامات الأخرى لموت الخلايا المبرمج النووي (مثل اختبار TUNEL ، تجزئة الحمض النووي التي يمكن اكتشافها وتجميع NPC). سيكون من المثير للاهتمام مقارنة التخلص من POM121 مع السمات المميزة الأخرى لموت الخلايا المبرمج (مثل إطلاق السيتوكروم ج من الميتوكوندريا ، أو انخفاض إمكانات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا أو ظهور فسفاتيديل سيرين على سطح الخلية). تجعل العلامات غير الغازية ، مثل POM121 الموسومة بـ GFP و cytochrome c (Goldstein et al. ، 2000) ، من الممكن دراسة انتشار موت الخلايا المبرمج في الخلايا الحية الفردية عن طريق الفحص المجهري الزمني ، وبالتالي فهي أدوات قيمة لدراسات الميكانيكية و الجوانب الزمنية لتطور موت الخلية. هذا صحيح بشكل خاص في ضوء الاكتشاف الأخير أن العوامل اللاجينية العكوسة قد تؤثر على تطور موت الخلايا المبرمج (جونز ، 2001).

توصيف الأجسام المضادة الجديدة ضد POM121. (أ) المناعة المناعية لخلايا BRL أحادية الطبقة مع الأجسام المضادة لـ POM121. يتم عرض قسم الرعي (أ) ، القسم الاستوائي (ب) وتلطيخ الحمض النووي المقابل (ج) لنواة خلايا BRL. بار ، 20 ميكرومتر. (ب) النشاف الغربي للبروتينات المنفصلة SDS-PAGE لأغشية المغلف النووي للفئران المستخلصة مع 7 أمتار من اليوريا (7M لأعلى) أو من lysates خلية كاملة من الثقافات أحادية الطبقة من خلايا BRL (BRL lyste) ، باستخدام الأجسام المضادة لـ POM121.

توصيف الأجسام المضادة الجديدة ضد POM121. (أ) المناعة المناعية لخلايا BRL أحادية الطبقة مع الأجسام المضادة لـ POM121. يتم عرض قسم الرعي (أ) ، القسم الاستوائي (ب) وتلطيخ الحمض النووي المقابل (ج) لنواة خلايا BRL. بار ، 20 ميكرومتر. (ب) النشاف الغربي للبروتينات المنفصلة SDS-PAGE لأغشية المغلف النووي للفئران المستخلصة مع 7 أمتار من اليوريا (7M لأعلى) أو من lysates خلية كاملة من الثقافات أحادية الطبقة من خلايا BRL (BRL lyste) ، باستخدام الأجسام المضادة لـ POM121.


تأثير مثيلة الحمض النووي على تحديد المواقع ومرونة الحمض النووي للنيوكليوسومات مع الحمض النووي الساتلي حول المركز

يحدث مثيلة الحمض النووي في مواقع CpG وهو مهم لتكوين مجالات كروماتين متغاير حول المركز. يقع تسلسل القمر الصناعي 2 ، الذي يحتوي على سبعة مواقع CpG ، في المنطقة المحيطة بمركز الكروموسوم البشري 1 ويتم ميثيلته بدرجة عالية في الخلايا الطبيعية. في المقابل ، يُقال إن منطقة الساتل 2 ميثيل ناقص الميثيل في الخلايا السرطانية ، مما يشير إلى أن حالة المثيلة قد تؤثر على بنية الكروماتين حول المناطق المحيطة بالمركز في الأورام. في هذه الدراسة ، قمنا بتعيين موقع النوكليوسوم على تسلسل القمر الصناعي 2 في المختبر ووجدت أن مثيلة الحمض النووي تؤثر بشكل متواضع على توزيع موضع النوكليوسوم. كشف فحص نوكلياز المكورات الدقيقة أن مرونة نهاية الحمض النووي للنيوكليوزومات تتغير ، اعتمادًا على حالة مثيلة الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن الهياكل والاستقرار الحراري للنيوكليوسومات لا تتأثر بمثيل الحمض النووي. توفر هذه النتائج معلومات جديدة لفهم كيفية عمل مثيلة الحمض النووي في تنظيم تكوين الكروماتين المتغاير حول المركز والمحافظة عليه في الخلايا الطبيعية والخبيثة.

1 المقدمة

مثيلة الحمض النووي هي علامة جينية مهمة تنظم تكوين نطاقات الكروماتين ، مثل الهيتروكروماتين [1-5]. في الثدييات ، يحدث مثيلة الحمض النووي في ثنائي النوكليوتيد CpG ويعتبر أنه يؤثر على بنية واستقرار الجسيم النووي ، وهو البنية الأساسية في الكروماتين [6-10]. في النواة ، يتم لف حوالي 150 زوجًا أساسيًا من الحمض النووي باليد اليسرى حول أوكتامر هيستون ، ويتكون من اثنين من كل من الهستونات الأساسية H2A و H2B و H3 و H4 [11-13].

يقال إن مثيلة الحمض النووي مرتبطة بوضع النوكليوزوم في جينومات النبات والثدييات [14 ، 15]. تُعرف مناطق الحمض النووي الجينومي ذات المحتوى العالي من CpG بجزر CpG ، ويبدو أن مثيلة CpG تلعب أدوارًا محورية في تنظيم الجينات وصيانة الحمض النووي الجيني [4،16،17]. تم الكشف عن حالات مثيلة الحمض النووي غير الطبيعية في العديد من الخلايا السرطانية [18،19]. جزر CpG هي في الغالب ناقصة الميثيل في الخلايا الطبيعية ، ولكنها مفرطة الميثيل في الخلايا السرطانية ، خاصة في محفزات الجينات الكابتة للورم [4،20،21]. في المقابل ، تم اكتشاف إزالة الميثيل من جزيرة CpG على نطاق واسع في محفزات الجينات الخاصة بالأنسجة في سرطانات الرئة [22]. تشير هذه النتائج السابقة إلى أن مثيلة الحمض النووي تعمل في التعبير الجيني الصحيح واستقرار الحمض النووي الجيني [23 ، 24].

تم اكتشاف عدم استقرار الكروماتين المتغاير في مناطق الأقمار الصناعية المحيطة بالوسط كحدث مبكر ومتكرر أثناء التسرطن البشري [25]. ومن المثير للاهتمام أن عدم استقرار الكروماتين المغاير يحدث بالتزامن مع الميثيل الناقص لمواقع CpG على الحمض النووي الساتلي [25-28]. ومع ذلك ، فإن الوسائل التي يؤثر بها هذا الاختلاف في حالة مثيلة CpG على السمات الهيكلية للنيوكليوسوم تظل بعيدة المنال.

في هذه الدراسة ، قمنا بإعادة تكوين النيوكليوسومات باستخدام شظايا دنا أقمار صناعية بشرية ميثلة وغير ميثلة 2 ، حيث ورد أن مواقع CpG تكون ناقصة الميثيل في السرطانات الخلوية [29]. كشفت تحليلاتنا البيوكيميائية والهيكلية أن مثيلة الحمض النووي أثرت على الموضع ومرونة نهاية الحمض النووي للنيوكليوزومات المجمعة على تسلسل القمر الصناعي 2 ، دون التأثير على الهياكل والثباتات النووية.

2. النتائج

2.1. تشكيل النيوكليوسوم على تسلسل القمر الصناعي البشري 2

قمنا أولاً بإعداد 160 زوجًا أساسيًا من شظية الحمض النووي للساتل البشري 2. يحتوي جزء الساتل 2 هذا على سبعة مواقع CpG ، TTCGAT ، TTCGAT ، TTCGAT ، TCCGAG ، TTCGAT ، TTCGAT و TTCGAG (من 5 إلى 3) ، والتي يحتمل ميثليتها في الخلايا الطبيعية (الشكل 1أ، اللوحة العلوية). لضمان ميثلة مواقع CpG هذه بالكامل ، تم استبدال جميع مواقع CpG بـ TTCGAA ، والتي يمكن شقها بواسطة إنزيم التقييد BstBأنا (الشكل 1أ، اللوحة السفلية). في هذه الدراسة ، تمت تسمية مشتق القمر الصناعي 2 باسم Sat2. كما هو مبين في الشكل 1ب (الممر 1) ، تم هضم جميع مواقع CpG في جزء الزوج الأساسي Sat2 160 بواسطة BstBI. كما هو متوقع ، فإن BstBتم منع الانقسام تمامًا عندما تمت معالجة جزء زوج القاعدة Sat2 160 باستخدام DNA methyltransferase مأنا (الشكل 1ب، الممر 2) ، مشيرًا إلى أن جميع مواقع CpG السبعة للساتل Sat2 تمت ميثليتها بالكامل.

الشكل 1. المواقف الانتقالية للنيوكليوسومات على الساتل البشري الميثيل وغير الميثيل 2 الحمض النووي. (أ) تسلسل الحمض النووي للساتل حول المركز البشري 2 (رمز الدخول NCBI: 603562 ، اللوحة العلوية). يتم تمثيل مواقع CpG السبعة بأحرف كبيرة حمراء. مشتق القمر الصناعي 2 (Sat2) ، حيث تم استبدال مواقع CpG السبعة للقمر الصناعي 2 بـ BstBمواقع التعرف (المميزة بالمستطيلات الصفراء) ممثلة في اللوحة السفلية. لإعداد جزء الحمض النووي ، يحتوي Sat2 على سابقة بمعنى البيئةمواقع RV على طرفي الحمض النووي (مظللة بواسطة مستطيلات أرجوانية). (ب) تحليل PAGE بدون تغيير طبيعة الحمض النووي Sat2 الميثلي وغير الميثيلي. تمت ميثلة جزء الحمض النووي بواسطة مأنا DNA methyltransferase ، ثم تعامل مع BstBأنا إنزيم التقييد (8 وحدات ميكروغرام -1 DNA ، حارة 2). يشير المسار 1 إلى تجربة تحكم بدون متم تحليل الحمض النووي (200 نانوغرام) بنسبة 10 ٪ PAGE مع تلطيخ بروميد الإيثيديوم. يشير الخط 3 إلى علامات سلم الحمض النووي المكونة من 10 أزواج أساسية. (ج) تم تحليل شظايا الحمض النووي الميثيل وغير الميثيل (30 نانوغرام) ، مع أو بدون معالجة MNase ، بواسطة PAGE غير المتحول. يشير الخط 1 إلى علامات سلم الحمض النووي المكونة من 10 أزواج أساسية. يشير الممران 2 و 3 إلى شظايا Sat2 DNA غير الميثيلية والممثلة. يشير الممران 4 و 5 إلى شظايا الحمض النووي لـ Sat2 DNA غير الميثيل وغير الميثيل ، المحمية من MNase. (د) رسم تخطيطي لمواقع النوكليوسوم متعدية ، يحددها التسلسل العميق بعد علاج MNase. تشير المربعات الصفراء إلى مواقع CpG. تمثل الأشكال البيضاوية الحمراء (على اليسار) والأزرق (المركز) والأخضر (الأيمن) المواضع الثلاثة للنيوكليوزوم المترجمة ، مع وجود محاور ثنائية تقع في 75 (± 3) ، 81 (± 3) و 88 (± 3) على التوالي. (ه) تمثيل رسومي للنسب النووية ، الموجودة في المواضع اليسرى والوسطى واليمنى. تمثل الأشرطة البيضاء والرمادية التجارب مع الحمض النووي Sat2 غير الميثيل والميثيل ، على التوالي. يتم عرض قيم الانحراف المعياري (ن = 3).

قمنا بعد ذلك بإعادة تشكيل النيوكليوسومات باستخدام شظايا سات 2 من الحمض النووي الميثيل أو غير الميثيل 160 زوجًا قاعديًا ، عن طريق طريقة غسيل الكلى بالملح. تمت معالجة النيوكليوسومات المعاد تكوينها باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) ، والتي تشق بشكل تفضيلي مقاطع DNA الوصلة المنفصلة عن سطح هيستون ، وتمت تنقية ما يقرب من 145 زوج قاعدي من شظايا الحمض النووي (الشكل 1).ج، الممرات 4 و 5). أجرينا بعد ذلك تسلسلًا متوازيًا على نطاق واسع (تسلسل عميق) باستخدام شظايا الحمض النووي المعالجة بـ MNase ووجدنا واحدًا رئيسيًا (يمينًا ، يُشار إليه بـ R) واثنان صغيران (في الوسط واليسار ، يرمزان إلى C و L ، على التوالي) مواقع نواة على تسلسل Sat2 (شكل 1د,ه). تم تعيين موضع R الرئيسي على الحافة اليمنى لجزء Sat2 DNA ، وتم تغيير المواضع C و L الثانوية بحوالي 7 و 13 زوجًا أساسيًا من الحافة اليمنى ، على التوالي (الشكل 1د). في كل من الحمض النووي Sat2 الميثلي وغير الميثيلي ، تم تشكيل حوالي 70 ٪ من النيوكليوسومات في الموضع R ، على الرغم من ملاحظة انخفاض طفيف مع Sat2 الميثيلى (الشكل 1ه). وبالمثل ، عند مثيلة الحمض النووي ، انخفض عدد النيوكليوسوم في الموضع C (الشكل 1ه). في المقابل ، تمت زيادة عدد سكان الموضع L بمقدار 1.5 ضعف عندما تم استخدام Sat2 الميثيل كركيزة (الشكل 1ه).

2.2. الهياكل البلورية للنيوكليوسومات التي تحتوي على الحمض النووي الميثيل Sat2R و Sat2L

لقد قمنا ببلورة النيوكليوسومات التي تحتوي على Sat2L الميثيل (145 زوجًا أساسيًا) و Sat2R (146 زوجًا قاعديًا) شظايا الحمض النووي وحدد هياكلها بدقة 2.63 و 3.15 ، على التوالي (الجدول 1 والشكل 2أ,ب). كمرجع ، حددنا أيضًا بنية النواة التي تحتوي على تسلسل Sat2R غير الميثيل بدقة 2.90 (الجدول 1 والشكل 2)ج). كانت هياكل أوكتامر هيستون في النيوكليوسومات التي تحتوي على DNA Sat2R و Sat2L المميثل هي نفسها الموجودة في النواة التي تحتوي على Sat2R DNA غير الميثيل (الشكل 2أج). بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن مسار ارتباط الحمض النووي في نيوكليوسوم Sat2R الميثلي مختلفًا عن المسار الموجود في نوكليوسوم R غير الميثيل (الشكل 2).د). كان مسار ارتباط الحمض النووي في نيوكليوسوم Sat2L الميثلي أيضًا هو نفسه الموجود في نوكليوسوم Sat2R غير الميثيل (الشكل 2ه). لذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن فرط الميثيل في مواضع CpG السبعة للحمض النووي Sat2 لا يؤثر على خاصية التفاف الحمض النووي الجوهرية في أوكتامر هيستون.

الشكل 2. التراكيب البلورية للنيوكليوسومات التي تحتوي على DNA Sat2 مميثل. (أ ، ب) الهياكل البلورية للنيوكليوسومات التي تحتوي على القمر الصناعي الميثلي 2 يسار (Sat2L) DNA (أ) والساتل الميثلي 2 الأيمن (Sat2R) DNA (ب). لم تكن السيتوزينات المكونة من 5 ميثيل مرئية في هذه الهياكل ، لأن النيوكليوسومات كانت معبأة بطريقة متداخلة في البلورات. (ج) التركيب البلوري للنيوكليوسوم الذي يحتوي على Sat2R DNA غير الميثيل. (د) يتم فرض بنية Sat2R DNA المميثل على بنية Sat2R DNA غير الميثلة في النيوكليوسومات. (ه) يتم فرض بنية Sat2L DNA المميثل على بنية Sat2R DNA غير الميثلة في النيوكليوسومات.

الجدول 1. جمع البيانات وإحصاءات صقلها (الاستبدال الجزيئي).


تم العثور على الحمض النووي المحتمل للديناصور

الأحفورة الصغيرة متواضعة ، مثل بقايا الديناصورات. انها ليست كبيرة مثل أباتوصور عظم الفخذ أو مثير للإعجاب مثل أ الديناصور فك. الكائن هو مجرد جزء ضئيل من الغضروف من جمجمة طفل يدعى هادروسور هيباكروسور التي هلكت منذ أكثر من 70 مليون سنة. لكنها قد تحتوي على شيء لم يسبق له مثيل من أعماق حقبة الدهر الوسيط: بقايا متدهورة من الحمض النووي للديناصورات.

ليس من المفترض أن تدوم المواد الجينية خلال مثل هذه الفترات الزمنية و mdashnot بفارق ضئيل. يبدأ الحمض النووي بالتحلل عند الموت. تظهر النتائج من دراسة أجريت عام 2012 على عظام moa أن الكائن الحي والمواد الوراثية rsquos تتدهور بمعدل يصل إلى النصف كل 521 عامًا. هذه السرعة تعني أن علماء الأحافير يمكنهم فقط أن يأملوا في استعادة تسلسلات الحمض النووي التي يمكن التعرف عليها من الكائنات التي عاشت وماتت خلال 6.8 مليون سنة الماضية و [مدشفار] أقل حتى من آخر الديناصورات غير الطافية.

ولكن بعد ذلك هناك هيباكروسور غضروف. في دراسة نُشرت في وقت سابق من هذا العام ، اقترحت عالمة الحفريات في الأكاديمية الصينية للعلوم Alida Bailleul وزملاؤها أنه في تلك الحفرية ، لم يجدوا فقط دليلًا على وجود بروتينات أصلية وخلايا مكونة للغضاريف ، بل عثروا على توقيع كيميائي يتوافق مع الحمض النووي.

إن استعادة المواد الجينية لهذه العصور القديمة سيكون بمثابة تطور كبير. العمل على المخلوقات المنقرضة مؤخرًا و [مدش] مثل الماموث وكسلان الأرض العملاقة و mdashpaleontologists تمكنت من مراجعة أشجار العائلة ، واستكشاف الترابط بين الأنواع وحتى اكتساب بعض الأفكار حول السمات البيولوجية مثل الاختلافات في التلوين. سيضيف الحمض النووي من الديناصورات غير الطافية ثروة من المعلومات الجديدة حول بيولوجيا السحالي الرهيبة. & rdquo ومن شأن هذا الاكتشاف أيضًا أن يثبت إمكانية بقاء المادة الجينية قابلة للاكتشاف ليس فقط لمليون سنة ، ولكن لعشرات الملايين. لن يكون سجل الحفريات مجرد عظام وآثار أقدام: بل سيحتوي على قصاصات من السجل الجيني الذي يربط جميع أشكال الحياة على الأرض.

ومع ذلك ، يحتاج علماء الأحافير أولاً إلى تأكيد أن هذه الآثار الجينية المحتملة هي الشيء الحقيقي. مثل هذه التشوهات المحتملة للحمض النووي القديم ليست بالضبط حديقة جراسيك& ndashquality. في أحسن الأحوال ، يبدو أن صانعيها البيولوجيين عبارة عن بقايا متحللة من الجينات لا يمكن قراءتها ومكوناتها المكسورة بدلاً من أجزاء سليمة من تسلسل. ومع ذلك ، فإن هذه التشوهات المحتملة للحمض النووي القديم ستكون أقدم بكثير (بملايين السنين) من أقرب أثر تالي للمادة الوراثية المتدهورة في السجل الأحفوري.

إذا تم التأييد ، فإن النتائج التي توصلت إليها بيلول وزملاؤها تشير إلى أن الآثار البيوكيميائية للكائنات الحية يمكن أن تستمر لعشرات الملايين من السنين أطول مما كان يعتقد سابقًا. وهذا يعني أنه قد يكون هناك عالم كامل من خبراء المعلومات البيولوجية هم فقط على دراية. & ldquo أعتقد أن الحفظ الاستثنائي هو حقًا أكثر شيوعًا مما نعتقد ، لأننا ، كباحثين ، لم ننظر إلى الحفريات الكافية بعد ، يقول بايليول. & ldquo يجب أن نستمر في البحث. & rdquo

السؤال هو ما إذا كانت هذه البروتينات والآثار الأخرى هي حقًا كما تبدو. في أعقاب Bailleul & rsquos paper & mdashand المستوحى من الجدل حول ما تمثله الجزيئات الحيوية داخل عظام الديناصورات وفريق مدشا المنفصل ، بقيادة عالم الجيولوجيا بجامعة برينستون رينكسينج ليانغ ، أبلغ مؤخرًا عن ميكروبات غير متوقعة وجدت داخل واحد من سنتروسور ، ديناصور مقرن من نفس العمر هيباكروسور. قال الباحثون إنهم اكتشفوا الحمض النووي داخل العظام ، لكنه كان من سلالات البكتيريا والكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي لم يتم رؤيتها من قبل. كان للعظم ميكروبيوم فريد خاص به ، والذي يمكن أن يسبب ارتباكًا حول ما إذا كانت البروتينات والمواد الجينية المحتملة تنتمي إلى الديناصور نفسه أو للبكتيريا التي استقرت فيه أثناء عملية التحجر.

إن اكتشاف أن مثل هذه الحفريات يمكن أن تؤوي مجتمعات بكتيرية مختلفة عن تلك الموجودة في الحجر المحيط يعقد البحث عن DNA الديناصورات والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى. قد يتم تراكب الحديث على الماضي ، مما يخلق صورة خاطئة. & ldquo حتى لو كان من الممكن الحفاظ على أي أثر عضوي ، كما يقول ليانج ، فإن عمليات تحديد الهوية ستكون صعبة مثل العثور على إبرة في كومة القش ، وبالتالي من المحتمل أن تؤدي إلى ادعاءات كاذبة محتملة. & rdquo

& ldquo في الوقت الحالي ، علم الحفريات الجزيئي مثير للجدل ، كما يقول بايليول. النقطة الشائكة الأولى هي أنه عندما يبحث الباحثون عن آثار للجزيئات البيولوجية القديمة ، فإنهم يستخدمون تقنيات تم اختراعها للعثور على الآثار السليمة التي تدهورت أو تغيرت بفترات طويلة من الزمن. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك الكثير من الخبراء لا يعرفون كيف يتغير عظام الديناصورات من الأنسجة العضوية في حيوان على قيد الحياة مؤخرًا إلى أحفورة صلبة بالمعادن. & ldquo لم نكتشف جميع الآليات المعقدة للتحجر الجزيئي باستخدام الكيمياء. ولا نعرف ما يكفي عن الأدوار التي تلعبها الميكروبات ، كما يقول بايليول. على سبيل المثال ، من غير الواضح كيف يمكن للميكروبات الحديثة خارج الأحافير أن تتفاعل مع تلك التي كانت تعيش داخل العظام.

هذه الأشياء المجهولة ، بالإضافة إلى البروتوكولات التي لا تزال قيد التطوير ، تغذي النقاش المستمر حول ما تمثله الحكايات البيولوجية داخل عظام الديناصورات. البحث عن هيباكروسور نظر الغضروف إلى تفاصيله المجهرية واستخدم البقع الكيميائية التي ترتبط بالحمض النووي. في المقابل ، الدراسة على سنتروسور يستخدم العظم تسلسل الحمض النووي لفهم طبيعة الآثار الجينية بداخله و [مدش] ، لكنه لم ينظر إلى بنيته المجهرية.

يقر Bailleul بأن النظر في أشكال الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة سابقًا عند دراسة علم الأحياء الدقيقة لعظام الديناصورات أمر مهم. لكنها تقترح أنه من غير المحتمل أن تجد البكتيريا طريقها إلى خلية غضروفية وتقليد نواتها بطريقة قد يخطئ فيها الباحثون في أن الكائنات الحية الدقيقة هي المادة الأصلية. ومع ذلك ، لا يمكن أن تكون & ldquoyou متشككة للغاية في نتائجك ، & rdquo يقول عالم الحفريات القديمة والمؤلف روس بارنيت ، الذي لم يشارك في الدراستين الموصوفتين أعلاه.

يقول بارنيت إن إحدى أكبر الصعوبات في الجدل الدائر هي الافتقار إلى التكرار. وقد مر علم الحفريات القديمة بهذه المشكلة من قبل: في وقت قريب من الفيلم حديقة جراسيك في عام 1993 ، بشرت الأوراق البحثية باكتشاف الحمض النووي لحقبة الحياة الوسطى. تم إبطال هذه الادعاءات في وقت لاحق عندما لم تتمكن فرق البحث الأخرى من تكرار نفس النتائج. على الرغم من أن علم الحفريات القديمة قد تغير منذ ذلك الوقت ، إلا أن الحاجة إلى مختبرات متعددة لتأكيد نفس النتيجة تظل مهمة. & ldquo إذا كان من الممكن إرسال أحافير من نفس الموقع إلى مختبر مختلف بشكل مستقل ، وعمل الأجسام المضادة الخاصة بهم ، والقيام بتلطيخهم والحصول على نفس النتائج ، فإن ذلك سيجعل الأمور أكثر تصديقًا ، كما يقول بارنيت. مثل هذا التعاون لم يحدث بعد لبعض التأكيدات على الحفاظ الاستثنائي على الديناصورات.

ومع ذلك ، فإن علم الأحياء القديمة الجزيئي يطور معايير للأدلة والبروتوكولات حيث يواصل البحث عن القرائن الموجودة داخل العظام القديمة. & ldquo وأتمنى أن يحاول العديد من علماء الأحافير أو علماء الأحياء ، أو كليهما ، القيام بذلك ، كما يقول بايليول. & ldquo يمكننا معرفة الإجابات بشكل أسرع إذا كنا نعمل جميعًا على هذا معًا. & rdquo

حتى إذا تبين أن العناصر العضوية المقترحة للديناصورات خاطئة ، فلا يزال من الممكن أن تؤدي الجهود المبذولة إلى فوائد غير متوقعة.يُعتقد أن المجتمعات البكتيرية تشارك في الحفاظ على العظام واستبدالها بالمعادن ، مما يساعد على تحويل بقايا الديناصورات إلى أحافير. & ldquo يمكن للدراسات المستقبلية حول الحمض النووي القديم من المجتمعات الميكروبية السابقة التي كانت تعيش داخل عظام الديناصورات أن تلقي مزيدًا من الضوء على دور الكائنات الحية الدقيقة في تحجر العظام والحفاظ عليها عبر الزمن الجيولوجي ، كما يقول ليانج.

& ldquo هذه أسئلة صعبة للغاية ، & rdquo يقول Bailleul. & ldquo ولكن إذا واصلنا المحاولة ، فهناك أمل في أن نكتشف معظم الإجابات. & rdquo كما هو الوضع الآن ، لا شيء مكتوب على الحجر.


الأنماط الظاهرية من الحمض النووي الخالي من الخلايا

الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) لديه القدرة على تمكين الاكتشاف غير الجراحي لحالات المرض وتطوره. إلى جانب تسلسلها ، يمثل cfDNA أيضًا المشهد النووي للخلية (الخلايا) من الأصل ويلتقط ديناميكيات الإيبيجينوم. في هذه المراجعة ، نسلط الضوء على ظهور طرق cfDNA epigenomic التي تقيم المرض خارج نطاق التنميط الجيني للورم الطافرة. الكشف عن طفرات الورم هو المعيار الذهبي لطرق التسلسل في علم الأورام السريري. ومع ذلك ، فإن القيود الملازمة لاستهداف الطفرات في cfDNA ، وإمكانيات الكشف عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء المرض ، جعلت الوراثة اللاجينية لـ cfDNA بديلاً مثيرًا. نناقش المعلومات اللاجينومية التي كشفت عنها cfDNA ، وكيف تستغل الطرق اللاجينومية cfDNA للكشف عن السرطان وتوصيفه. التطبيقات المستقبلية لأساليب cfDNA epigenomic للعمل بشكل متكامل ومتعامد مع الممارسات السريرية الحالية لديها القدرة على تحويل إدارة السرطان وتحسين نتائج مرضى السرطان.

1 المقدمة

الدم هو مصدر طفيف التوغل لتتبع الحالة الصحية للفرد. تُعلمنا معظم الجزيئات الحيوية المعروفة الموجودة في الدم ، مثل البروتينات ، والحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والدهون ، والمستقلبات ببعض جوانب وظائف الجسم. ومع ذلك ، لا يزال استخدام الدم لتشخيص وتتبع السرطان يمثل تحديًا كبيرًا. يمكن للتشخيصات طفيفة التوغل للسرطان أن تقلل بشكل كبير من آلام ومعاناة المرضى ، وإذا كانت أرخص من الطرق الحالية ، فيمكن إجراؤها في كثير من الأحيان أثناء العلاج لمراقبة حالة المرض وإبلاغ الرعاية السريرية. يتمتع التوصيف الجيني للسرطان إما من الخزعات أو الحمض النووي الخالي من خلايا البلازما (cfDNA) بإمكانية إضافية لتوفير خيارات العلاج الشخصية.

cfDNA هو حمض نووي مرتبط بحيدات النواة ويوجد في الدم خارج الخلية. تم تحديد cfDNA لأول مرة في عام 1948 [1] في دم المرضى ، ومع ذلك ، فإن الفرضية القائلة بأن cfDNA يعمل بمثابة انعكاس لحالة المرض نشأت من الملاحظات في عام 1977 [2]. كانت هذه العلاقة بين cfDNA والمرض موضوعًا للدراسة منذ ذلك الحين. هناك العديد من المسارات المحتملة لإطلاق شظايا الحمض النووي من الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والنخر ، وإفراز الجسيمات الخارجية [3-6]. تشمل العمليات التي تزيد من إفراز حمض الحمض النووي الريبي (CFDNA) المرض ، والالتهاب ، وإصابة الأنسجة ، والتمارين الرياضية [7،8]. في الأفراد الأصحاء ، يعتبر النضج المكون للدم مساهماً رئيسياً في تجمع الحمض النووي الريبي الحميد الطبيعي. لوي وآخرون. أظهر بأناقة أن الأنسجة اللمفاوية / النخاعية هي المساهم الرئيسي في cfDNA من خلال تحديد تسلسل الكروموسوم Y في بلازما المتلقين الإناث لزرع نخاع العظم من المتبرعين الذكور [9]. أكدت دراسات متعددة منذ ذلك الحين أن الأنسجة اللمفاوية / النخاعية تساهم بشكل رئيسي في تجمع cfDNA الطبيعي [10-13]. الأورام ، عند وجودها ، تساهم أيضًا في cfDNA. وبالتالي ، فإن cfDNA عبارة عن رمز شريطي جزيئي للخلايا التي تخضع لعملية دوران وهي هدف جذاب للتشخيص السريري والمراقبة في الوقت الحقيقي للعديد من السرطانات.

شريطة أن تكون هناك طرق لتمييز cfDNA الناشئة في موقع المرض عن cfDNA المنتجة أثناء الدوران الطبيعي ، يمكن استخدام cfDNA للتشخيص. كان التركيز الرئيسي لاستخدام cfDNA لتشخيص السرطان هو تحديد مجموعة محدودة من الطفرات الخاصة بمرض معين. ومع ذلك ، فإن اكتشاف الطفرات له قيود كبيرة: يساهم تكوين الدم النسيلي في جزء كبير من الطفرات في cfDNA ، بما في ذلك الطفرات في الجينات البارزة المرتبطة بالسرطان مثل TP53 و DNMT3A [14]. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطفرات في cfDNA من المراحل المبكرة من المرض يمكن أن لا يمكن تمييزها عن الطفرات التي تنشأ بمعدلات ملحوظة في الأنسجة السليمة [15،16]. أدت هذه العقبة الرئيسية إلى استكشاف المعلومات المتعامدة الأخرى في cfDNA التي يمكن أن تحدد نسيجها الأصلي ، وبالتالي حالات المرض. تعكس Epigenomes الهوية الخلوية والنمط الظاهري ، ويمكن استخدام قدرتنا على ربط epigenomes بالهوية الخلوية لاستنتاج الأنماط الظاهرية للمرض من cfDNA. بشكل ملحوظ ، ستكون مناهج cfDNA المستندة إلى الإيبيجينوم متعامدة ومكملة لمقايسات cfDNA القائمة على الطفرات. في هذه المراجعة ، نناقش ميزات epigenome التي يمكن تمييزها في cfDNA ، والتي توفر معلومات عن نسيج cfDNA المنشأ.

2. يحتوي الحمض النووي الخالي من الخلايا على خريطة لحالة الكروماتين في نسيج المنشأ

أدت دورية الحمض النووي السيتوبلازمي الذي يتم إطلاقه أثناء نضوج خلايا الدم الحمراء في كبد جنين الفأر إلى فرضية أن هناك ترتيبًا منتظمًا لحماية البروتين على الجينوم [17 ، 18]. سبق هذا العمل كل من مجال الاستماتة والتوصيف الكيميائي الحيوي للنيوكليوزوم وقدم أول تلميح إلى أن cfDNA يمكن أن يكون خريطة لهيكل الكروماتين. يستمر الدنا المرتبط بالبروتين لفترة أطول من الدنا العاري في مصل الدم [19] ، حيث تتوافر نوكليازات بكثرة ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي النووي (cfDNA) من المحتمل أن يكون مزدوج الشريطة ومرتبطًا بالبروتين لمنع التحلل بواسطة نوكليازات داخلية المنشأ في البلازما. يتم دعم ذلك من خلال القدرة على اكتشاف النيوكليوسومات في البلازما عن طريق مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) والترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) [20-24].

موت الخلايا المبرمج هو إحدى العمليات التي يمكن أن تؤدي إلى تجزئة الجينوم إلى مجمعات صغيرة من البروتين والحمض النووي الموجودة في الدورة الدموية. ينطوي موت الخلايا المبرمج على زيادة تنظيم نوكليازات التي تهاجم جينوم الخلية. من سمات هذا "الهجوم" تجزئة الحمض النووي التي تؤدي إلى تسلسل الأنواع المتكررة أقل من 5 كيلو بايت [5،25]. تتوافق وحدة التكرار في التسلسل المرئي في موت الخلايا المبرمج مع ما يقرب من 150 نقطة أساس ، وهو ما يوازي طول الحمض النووي الملفوف حول النواة. لذلك ، فإن cfDNA البلازمي ، والذي يكون عادةً في شكل أحادي النواة ، يخبرنا عن بنية الكروماتين للخلايا التي تخضع لعملية دوران. بعبارة أخرى ، يمكن قياس "epigenome" لنسيج المنشأ من cfDNA (الشكل 1).

الشكل 1. يعكس الحمض النووي الخالي من الخلايا المعلومات اللاجينومية الهيكلية لخلية المنشأ. رسم تخطيطي لاختلافات المشهد النووي للجين X عندما لا يتم التعبير عنه (يسار) ويتم التعبير عنه (يمين) في أنواع مختلفة من الخلايا. (أ) يتميز الجين غير المعبر عنه بميثيل الحمض النووي القريب (علامات حمراء) ، مثيلة ذيول الهيستون النووية (الأعلام الحمراء ، H3K27me3) ، انسداد النواة في المروج (السهم) ، نقص عوامل النسخ (TFs) المنبع من المروج ، وغياب RNA polymerase II (RNAPII). (ب) في الجينات المعبر عنها ، تكون النيوكليوسومات في وضع جيد ، والتعديلات مثل H3K4me3 (الأعلام الخضراء) موجودة ، و RNAPII تحتل المروج ، و TFs مرتبطة في المنبع. في النواة +1 أثناء استطالة النسخ ، يكسر RNAPII بشكل عابر اتصالات DNA-هيستون مما يسمح بتبادل ثنائيات H2A-H2B (الهلال الأزرق الفاتح). النيوكليزات ، التي تظهر على شكل مقص ، موجودة في كل مكان وتفضل تشق الحمض النووي الذي يمكن الوصول إليه. في الجين X ، عندما تتغير حماية البروتين للحمض النووي أثناء أحداث إعادة تشكيل الكروماتين ، مثل النسخ ، فإن نشاط نوكلياز يلتقط الحماية المختلفة لطول الحمض النووي (انظر أطوال الأجزاء). (ج) أثناء دوران الخلايا ، يتم إطلاق مجمعات بروتين الحمض النووي في الدورة الدموية. (دتحافظ معقدات بروتين الدنا المنتشرة في البلازما على السمات اللاجينومية للحالة النسخية لخلية المنشأ. تتضمن هذه الميزات أطوال الأجزاء (حماية البروتين والحمض النووي) ، ومثيلة الحمض النووي ، وملامح تحديد المواقع النووية ، والتعديلات اللاحقة للترجمة النووية. لاحظ الحفاظ على هذه الأنواع من بروتينات الدنا النسخية وغير النسخية من الجسم إلى البلازما.

3. علم الوراثة الهيكلية

من المعروف منذ فترة طويلة أن بنية الكروماتين في الخلايا يمكن استنتاجها من أنماط هضم النيوكليازات الحساسة لاتصالات البروتين والحمض النووي [26]. تم استخدام نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) لدراسة بنية الكروماتين لعقود [27]. إن فهم بنية الكروماتين عن طريق تسلسل الأجزاء المحمية من هضم MNase له تشابه غير متوقع في cfDNA. يمكن للمعلومات المستمدة من طول الجزء وموقع الجينوم أن تخبرنا عن النشاط الكيميائي الحيوي في موضع الجينوم لـ MNase و cfDNA. بالنسبة لـ cfDNA ، يمكن استخدام هذا لاستنتاج نشاط النسخ ونسيج المنشأ. كما سنوضح أدناه ، يمكن أن يخبرنا الطول والموقع الجيني للشظايا المحمية من النيوكلياز بالتوزيع الخاص بالموقع للنيوكليوزومات وعوامل النسخ (TF) والوسيطات النووية المتكونة أثناء النسخ (الشكل 1). القدرة على تحديد الهياكل الخاصة بالموقع لمجمعات البروتين-DNA من بيانات التسلسل ، والتي يطلق عليها "علم الوراثة الهيكلية" ، هي استراتيجية عامة قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات ، بما في ذلك مجموعات بيانات تسلسل cfDNA [11].

4. تعكس مواقع النيوكليوسوم وظيفة الجينوم

يتم تعبئة الحمض النووي الجيني حقيقيات النوى بالنيوكليوسومات مثل "خرز على خيط" ويتم فصل النيوكليوزومات المتتالية بواسطة DNA رابط قصير [28 ، 29]. يحلل MNase بشكل تفضيلي DNA الرابط ويتم تثبيطه عندما يواجه اتصال بروتين DNA [27،30]. يحمي النيوكليوسوم 147 نقطة أساس من الحمض النووي ، والكروماتوسوم (الجسيم النووي مع رابط هيستون المرتبط) يحمي 167 نقطة أساس من الحمض النووي ، وتحمي TFs أقل من 50 نقطة أساس من الحمض النووي. تم استخدام MNase تقليديًا لرسم خرائط لمواضع النيوكليوسومات الكاملة في نوى سليمة عن طريق تنقية ما يقرب من 147 نقطة أساس من الحمض النووي بعد هضم MNase وإخضاع هذا الحمض النووي لتسلسل قراءة قصيرة متوازية بشكل كبير [31]. يؤثر تحديد موقع النيوكليوسوم على جميع العمليات الكيميائية الحيوية التي تحدث على الجينوم ، وبالتالي ، فإن معرفة مواقع الجينوم تمكننا من التنبؤ بالأنشطة الكيميائية الحيوية التي حدثت في الخلايا التي أدت إلى هذه الحماية [32]. تم العثور على مثال صارخ على تنظيم نووي متميز في الجينات النشطة. هناك استنفاد للنيوكليوسومات في المحفزات النشطة والنيوكليوسومات مرتبة جيدًا في بداية ونهاية المروجين النشطين. يحتوي cfDNA على معلومات حول تحديد المواقع النووية وتم الحصول على خرائط نوكليوزوم عالية الجودة من تسلسل cfDNA عميق الجينوم الكامل من بلازما المتبرعين الأصحاء [12 ، 33-35].

كثافة النيوكليوسوم المستدل عليها من cfDNA للأفراد الأصحاء لها نفس الميزات مثل تلك الموجودة في خطوط الخلايا اللمفاوية: الجينات المعبر عنها بشكل كبير في خطوط الخلايا الليمفاوية تميزت باستنفاد النواة في المروجين ومواقع النوكليوزوم المطلوبة في المنبع والمصب للمروج في cfDNA (الشكل 1). على النقيض من ذلك ، أظهرت الجينات التي لم يتم التعبير عنها في خطوط الخلايا هذه كثافة نواة كبيرة على المحفزات ونقصًا في ترتيب الأجسام الجينية في cfDNA [12 ، 35]. أثبتت هذه الملاحظات بقوة الأصل اللمفاوي / النخاعي للـ cfDNA في البشر الأصحاء.

تم تطوير الدرجات الكمية بناءً على هذه الملاحظات المذهلة لربط ملفات تعريف النواة بالنشاط الجيني في نسيج cfDNA المنشأ. سنايدر وآخرون. أظهر أن دورية أقوى للنيوكليوسومات في جسم الجين (المنطقة الواقعة بين موقع بدء النسخ (TSS) و TSS + 5000 نقطة أساس) مرتبطة بتعبير جيني أعلى في الأنسجة اللمفاوية / النخاعية للمتبرعين الأصحاء [12]. ومع ذلك ، في cfDNA من متبرعين مصابين بالسرطان ، كان الارتباط بين دورية النواة في أجسام الجينات مع التعبير الجيني للأنسجة اللمفاوية / النخاعية أضعف بكثير ، مما يشير إلى أنواع الخلايا الأخرى التي تساهم في تجمع cfDNA. تم تأكيد ذلك من خلال حقيقة أن ارتباط الدورية بالتعبير الجيني لأنواع الخلايا الأخرى زاد بالنسبة للمتبرعين بالسرطان [12]. وبالتالي ، يمكن أن تفيد دورية النواة في التعبير الجيني لنسيج (أنسجة) cfDNA من الأصل.

أولز وآخرون. لاحظ أن الكثافة الكلية للنيوكليوسوم كانت أقل في 2 كيلو بايت في المنبع والمصب من TSS (والتي أطلقوا عليها اسم '2 K-TSS') وأقل في المروج نفسه (يُطلق عليه عادةً `` المنطقة المستنفدة للنيوكليوسوم '' ، NDR) في الجينات المعبر عنها في كليهما MNase-seq لخط الخلية اللمفاوية وبيانات تسلسل cfDNA من متبرعين أصحاء [35]. طوروا نموذجًا يستخدم الإشغال النووي عند 2 K-TSS و NDR للتنبؤ بالتعبير الجيني. في الشخص المصاب بالسرطان ، قد يكون للـ cfDNA المتسبب في الورم استنفاد النيوكليوزومات في الجينات النشطة ، ولكن قد يتم إخفاء هذا النضوب عن طريق الإشغال النووي العالي في cfDNA من الأنسجة اللمفاوية / النخاعية. أولز وآخرون. تحايلت على هذه المشكلة من خلال التركيز على مناطق في الجينوم ظهرت مكاسب في عدد النسخ في cfDNA للمتبرعين المصابين بالسرطان. هذه المناطق الجينومية سيكون لها تمثيل أعلى في الورم cfDNA إذا كان الورم هو مصدر هذه الزيادة في عدد النسخ. اقترحت عمليات المحاكاة الخاصة بهم أنه يجب إطلاق 75 ٪ على الأقل من cfDNA عند TSS معين من الخلايا السرطانية لاستنتاج حالة التعبير باستخدام طريقتهم. في مناطق اكتساب عدد النسخ ، أظهروا تغييرات كبيرة في إشغال النواة عند 2 K-TSS و NDR التي ارتبطت بزيادة التعبير عن هذه الجينات في الورم كما تم تقييمه بواسطة RNA-seq لعينات خزعة الورم المتطابقة. وبالتالي ، فإن استنفاد المروج والجسم الجيني لشظايا cfDNA يدل على نشاط الجين في نسيج منشأ cfDNA.

5. توحي النواة الفرعية في الحمض النووي الخالي من الخلايا بحالة التعبير عن الجينات

يؤدي النسخ أيضًا إلى تكوين جسيمات سفلية قريبة من المحفز ، ويمكن أن يكون تحديد الجينات الفرعية بمثابة وكيل لقياس نشاط الجين. في الخلايا حقيقية النواة ، يحدث النسخ على قالب كروماتين. نظرًا لأن RNA polymerase II (RNAPII) يحتاج إلى فك خيوط الحمض النووي لصنع الحمض النووي الريبي ، فإن كل اتصال بروتين و DNA في مساره يحتاج إلى التعطيل. في المختبر، تمثل النيوكليوسومات حاجزًا كبيرًا أمام استطالة النسخ [36 ، 37] ، مما يؤدي إلى توقف معين بواسطة RNAPII في مواقع التلامس القوي للحمض النووي والهيستون. في الخلايا ، يمكننا تعيين المواضع التي توجد بها أكشاك RNAPII مع خرائط دقة الأزواج الأساسية للنهايات الثلاثة للنصوص الوليدة [38-41]. أظهرت هذه الخرائط أن أول جسيم نووي في اتجاه مجرى TSS (+1 nucleosome) يمثل حاجزًا قويًا أمام RNAPII في الخلايا.

يمكن فهم تأثير توقف RNAPII على النوكليوسوم +1 من خلال رسم خرائط للحالات النووية الوسيطة أثناء استطالة النسخ. باستخدام بروتوكولات مكتبة التسلسل التي تلتقط جميع أطوال الأجزاء جنبًا إلى جنب مع تسلسل الطرف المزدوج ، يمكن الكشف عن الطيف الكامل للشظايا الناتجة عن معالجة MNase للنواة [11،42-44]. الشظايا بين 50 و 147 نقطة أساس قصيرة جدًا بحيث لا يمكن حمايتها بواسطة نواة كاملة ، ولكنها طويلة جدًا بحيث لا يمكن أن تكون آثار أقدام TF. تمثل هذه الحماية متوسطة الطول فقدانًا منفصلاً للاتصالات بشكل غير متماثل من أي من جانبي النواة لأنها تنفصل أثناء النسخ وإعادة التشكيل (الشكل 1). كشف ربط خريطة دقة زوج القاعدة لـ RNAPII مع التوزيع عالي الدقة للوسائط النووية في الجسيم النووي +1 أن فك النوكليوزوم يحدث بطريقة متدرجة - أولاً ، يتم فقد جهات الاتصال ثنائية H2A-H2B القريبة من المحفز. ثم مع استطالة RNAPII عبر النواة ، تُفقد الاتصالات بثنائي H2A-H2B القاصي للمحفز [11]. أسفر الفحص المجهري الإلكتروني للنيوكليوسومات غير المغلفة وقوالب نسخ RNAPII عن هياكل تتطابق مع في الجسم الحي الهياكل المستدل عليها من تسلسل الطرف المزدوج [45-47]. تسلط هذه الملاحظات الضوء على قدرة التسلسل الجيني لشظايا الحمض النووي القصيرة للكشف عن البنى التحتية المعتمدة على النسخ للنيوكليوسومات في الخلايا.

إن cfDNA شديد التكسير وفقد الحمض النووي المكسور في بروتوكولات إعداد المكتبة القياسية مزدوجة الشريطة. مستوحى من الأساليب المستخدمة في مشاريع تسلسل الجينوم لإنسان نياندرتال ، سنايدر وآخرون. استخدم بروتوكول مكتبة أحادي الجديلة (SSP) يلتقط كلاً من الأجزاء المكسورة وغير المصقولة [12 ، 48]. والمثير للدهشة أنهم وجدوا وفرة من الشظايا أقل من حجم النواة ، تتراوح من حوالي 40 نقطة أساس فصاعدًا. تشبه هذه الأجزاء القصيرة النواة الفرعية التي لوحظت في بيانات تسلسل MNase من ذبابة الفاكهة الخلايا [11]. عندما تم تعيين شظايا cfDNA تحت النواة في +1 مواقع جينية من الجينات المعبر عنها في الأنسجة اللمفاوية / النخاعية ، فإن نفس الوسطاء غير المتماثل الذي شوهد في ذبابة الفاكهة يمكن أيضًا ملاحظة الخلايا في بيانات cfDNA [11]. وبالتالي ، يبدو أن وقت الإقامة الطويل لـ RNAPII بالقرب من النواة +1 يؤدي إلى حالات وسيطة نواة طويلة العمر يمكن رسمها بواسطة MNase وكذلك من خلال نوكليازات داخلية المنشأ التي تؤدي إلى ظهور cfDNA.

في ذبابة الفاكهة الخلايا ، فقد وجد أن كمية الجسيمات تحت النواة بالنسبة للجسيمات النوكليوزومية في النوكليوزوم +1 لجين يرتبط بمدى نسخ هذا الجين [11]. لذلك ، تم الافتراض أن كمية هذه الوسطاء بالنسبة إلى النيوكليوسومات الكاملة (تخصيب النواة الفرعية) في +1 نواة الجينات في cfDNA سترتبط بملف تعريف التعبير المركب للخلايا مما يؤدي إلى ظهور cfDNA. في الواقع ، في متبرع سليم ، ارتبط تخصيب cfDNA subnucleosome بشكل أفضل بكثير مع ملامح التعبير لأنواع الأنسجة اللمفاوية / النخاعية مقارنة بأنواع الأنسجة الأخرى. ومع ذلك ، في المتبرعين المصابين بالسرطان ، فإن الإثراء تحت النواة المقابل للأنسجة اللمفاوية / النخاعية يضعف إلى حد كبير ، مما يتيح تمايزًا قويًا بين البلازما السليمة والسرطانية cfDNA [11]. وبالتالي ، فإن النواة الفرعية في cfDNA تمثل بقايا النسخ في أنسجة cfDNA التي يمكن أن تخبرنا عن برامج النسخ النشطة في مواقع المرض.

6. ارتباطات بنية الكروماتين عبر القواعد الضخمة

يمكن تمديد الملاحظة التي تفيد بأن ديناميكيات النوكليوسوم تنعكس من خلال الحماية الأقصر في cfDNA إلى مقاييس طول أكبر بكثير من النيوكليوسومات المفردة ، مما يسمح بالاستخدام الأقصى لبيانات تسلسل cfDNA منخفضة العمق. باستخدام نموذج التعلم الآلي ، كريستيانو وآخرون. كانوا قادرين على ملاحظة "ملامح تجزئة" مماثلة في المقاييس الضخمة بين cfDNA من متبرعين أصحاء والحمض النووي الناتج عن علاج MNase للخلايا الليمفاوية السليمة [49]. ملف تعريف التجزئة هو مقياس مشابه للتخصيب تحت النواة: نسبة الأجزاء الصغيرة (100-150 نقطة أساس) إلى شظايا cfDNA الكبيرة (151-220 نقطة أساس). لوحظ اختلاف كبير في ملامح التجزئة بين cfDNA من المتبرعين الأصحاء والمتبرعين المصابين بالسرطان ، مما يتيح الكشف عن السرطان بتسلسل cfDNA كامل الجينوم منخفض العمق. من المفترض أن تعمل هذه الطريقة لأن ملفات تعريف التجزئة بمقاييس الطول الكبيرة تفرق بين المجالات النشطة للكروموسوم والمجالات غير النشطة. من المتوقع أن يكون للورم نطاقات كروماتين نشطة مختلفة بشكل كبير على مقياس الميجاباز مقارنة بالأنسجة اللمفاوية / النخاعية.

فرضية مماثلة هي أن قوة الارتباط لمحات طول cfDNA بين المواقع الجينومية تتناسب مع ارتباط جهات الاتصال التي أجراها الموقع مع بقية الكروموسوم [50،51]. يمكن الحصول على مصفوفة ارتباط احتمالية التلامس لنوع خلية بواسطة Hi-C [52]. تتضمن طريقة Hi-C تشابك الخلايا ، وتجزئة الجينوم إلى أجزاء كبيرة مع سلامة الروابط المتقاطعة ، ثم ربط الأجزاء المتشابكة. يكشف تسلسل جهات الاتصال المربوطة عن اتصالات الكروماتين على مستوى الجينوم. تشترك مناطق الجينوم ذات النشاط المماثل في ملفات تعريف اتصال مماثلة عبر الكروموسوم. ليو وآخرون. أظهر أن قوة الارتباط لمحات طول cfDNA الصحية بين المناطق الجينومية المختلفة تتناسب مع قوة ارتباط جهات الاتصال Hi-C بين المناطق الجينومية المختلفة كما تم قياسها في الخلايا الليمفاوية. علاوة على ذلك ، يمكن نمذجة هذا الارتباط لمحات طول cfDNA بين مناطق مختلفة من الكروموسوم كمزيج من خرائط Hi-C لأنواع الأنسجة المختلفة للكشف عن مساهمات الأنسجة في cfDNA في عينات الورم ذات كسور الورم العالية (أكبر من 30٪) [50 ]. وبالتالي ، يمكن استخدام ملفات تعريف cfDNA لاستنتاج اتصالات الكروموسوم في الأنسجة (الأنسجة) من الأصل.

7. أنماط DNA خالية من الخلايا مميزة في مواقع ارتباط عامل النسخ

تُظهر مواقع ربط TF في المروجين والمعززات والعوازل إثراءًا للحماية القصيرة (أقل من 50 نقطة أساس) واستنفاد النيوكليوسومات في تجارب MNase-seq [11،42،43،53-55]. يؤدي ارتباط العديد من TFs أيضًا إلى ترتيب النيوكليوسومات حول مواقع ارتباط TF [56]. وبالتالي ، تمثل مواقع ربط TF المحمية فئة منفصلة من المواضع الجينية التي تُظهر ملامح هيكلية مميزة للكروماتين في فحوصات حماية نوكلياز. إثراء الأجزاء القصيرة في cfDNA باستخدام SSP ممكّن Snyder وآخرون. لمراقبة الإثراء المماثل للحماية القصيرة والمصفوفات النووية المطلوبة في مواقع ربط TF في مجموعات بيانات cfDNA من البلازما الصحية. لاحظوا أيضًا إثراء الأجزاء القصيرة في cfDNA في المحفزات التي كانت متناسبة مع مستويات التعبير لخط الخلية اللمفاوية ، مما يدل على القدرة على التعرف على المجمعات النسخية في المروج من cfDNA [12].

أولز وآخرون. وجد أن استنفاد أحادي النواة الذي لوحظ في cfDNA في مواقع ارتباط TF المعروفة (TFBSs) هو وكيل جيد لاستنتاج ارتباط TF [57]. يتيح ذلك استنتاج ارتباط TF من تسلسل cfDNA باستخدام بروتوكولات قياسية مزدوجة تقطعت بهم السبل لا تخصيب الأجزاء القصيرة. قاموا باختيار مجموعة من TFs الخاصة بالنسب ، على سبيل المثال ، مستقبلات الأندروجين (البروستاتا) ، Even-Skipped Homeobox 2 (القولون) ، Forkhead box A1 (الثدي) ، ولكل منها ، تم تحديد 1000 موقع ربط كانت متوافقة عبر عينات الأنسجة [58]. باستخدام البلازما من المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا والثدي والقولون ، أظهروا أن مستويات نضوب النواة في مواقع ارتباط TFs الخاصة بالورم أعلى بكثير مقارنة بالأتراب الصحي والعكس كان صحيحًا في مواقع الربط لـ TFs الخاصة بالنسب المكونة للدم مثل LYL1 و EVI1. بالإضافة إلى ذلك ، أظهروا أيضًا أن مستويات استنفاد النوكليوسوم في TFBSs محددة كانت تنبؤية لأنواع فرعية من الورم. على سبيل المثال ، وجدوا انخفاضًا كبيرًا في استنفاد النوكليوسوم في مواقع ربط مستقبلات الأندروجين عند مقارنة العينات من قبل وبعد أن أصبح سرطان البروستاتا لدى المريض مستقلًا عن الأندروجين. وبالتالي ، يمكن الاستدلال على ارتباط TF من cfDNA إما مباشرة من خلال حماية شظية قصيرة عند استخدام SSP أو بشكل غير مباشر عبر استنفاد النواة في TFBSs عند استخدام بروتوكولات مكتبة قياسية مزدوجة تقطعت بهم السبل و TFBSs الخاصة بالأنسجة تمكن من تحديد الأنسجة التي تساهم في cfDNA.

8. طول جزء الحمض النووي الخالي من الخلايا

كما ناقشنا أعلاه ، يعكس طول cfDNA بنية الكروماتين في الخلايا الأصلية ويمكن نمذجتها بشكل صريح على هذا النحو. إلى جانب محاولة فهم ملفات تعريف cfDNA من حيث بنية الكروماتين ، كانت هناك العديد من الملاحظات المفيدة حول استخدام طول cfDNA في تطوير العلامات الحيوية ، والتي لا يمكننا إلا التكهن بالتفاصيل الجزيئية الأساسية. بشكل عام ، يتم استخدام حجم شظايا cfDNA لتحديد بين التوازن الأساسي والظواهر البيولوجية الأخرى التي تؤدي إلى ظهور cfDNA. تم بالفعل تطبيق cfDNA مباشرة في العيادة لاختبار ما قبل الولادة. في البلازما ، يكون cfDNA الجنيني أقصر من cfDNA الأمومي [13،59،60] ، مما يتيح الكشف عن اختلال الصيغة الصبغية أو الاضطرابات المتنحية في الجنين بشكل غير جراحي. يتميز cfDNA في البول بأجزاء دورية قصيرة تشبه النواة الفرعية [51]. في الأفراد المصابين بالسرطان ، يتواجد DNA الورم المنتشر في الجزء الأقصر من cfDNA [61-63]. عادةً ما يكون تواتر cfDNAs الأقصر غير الورمي منخفضًا ، وبالتالي فإن اختيار الحجم للأجزاء الأقصر يمكن أن يزيد بشكل كبير من حساسية الكشف عن الورم الطافر cfDNA. يتم تحقيق استهداف الطفرة وتحديد تباين رقم النسخ و / أو تعديلات رقم النسخة المفردة بحساسية أعلى إذا تم تحديد جزء cfDNA الأقصر [61،62]. هذا هو نتيجة لتخفيف cfDNA الورم الطافر بدرجة أقل مع cfDNA غير الورمي في الجزء الأقصر. في ضوء هذه الملاحظات ، فإن أحد التنبؤات هو أن cfDNA الأقصر هو نتاج آلية محددة تحدث بتردد أعلى في الخلايا الجنينية ، والخلايا التي تؤدي إلى ظهور cfDNA في البول ، والخلايا السرطانية نسبة إلى معدل دوران الخلايا اللمفاوية / النخاعية الطبيعي .

9. يستخدم الترسيب المناعي لكروماتين الحمض النووي الخالي من الخلايا أنماط جينوم خاصة بنوع الخلية من تعديلات هيستون لتحديد الأنسجة الأصلية

استخدمت العديد من الدراسات في أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين ELISA لالتقاط وحساب تركيز النيوكليوسومات في البلازما [20،22–24،64،65]. على وجه التحديد ، تم التقاط النيوكليوسومات في "شطيرة" جسم مضاد ، والتي تستخدم الجسم المضاد للهيستون والجسم المضاد للحمض النووي المزدوج الشريطة. كان هذا النهج وسيلة بديلة لتقييم موت الخلايا باستخدام البلازما من مرضى السرطان. في دراسة بارزة ، أظهر مرضى السرطان زيادة ذات دلالة إحصائية في تركيز النوكليوسوم مقارنة بالأفراد الأصحاء [20]. تشير هذه النتائج إلى أن تركيز النوكليوسوم يمكن أن يعمل كمؤشر حيوي لحالة مرضية و / أو يميز بين الأفراد المصابين بالمرض والذين يتمتعون بصحة جيدة. ومع ذلك ، يفتقر هذا التطبيق إلى معلومات جينومية محددة لتحديد نسيج المنشأ وتحديد حالة المرض.

بعيدًا عن الاختلافات في تركيزات النوكليوسوم الإجمالية بين الحالات الفسيولوجية ، فإن السؤال المثير للاهتمام هو ما إذا كان يمكن استخدام التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للهيستونات النووية في البلازما للتمييز بين الأفراد الأصحاء وأولئك الذين يعانون من المرض (الشكل 1). تختلف PTMs للهيستونات النووية والحمض النووي في مناطق متجانسة اللون مقابل المناطق غير المتجانسة [66،67]. تتراوح PTM من مجموعات كيميائية صغيرة إلى بروتينات أكبر ، مثل يوبيكويتين ، التي تضاف إلى أحماض أمينية معينة من البروتينات. على سبيل المثال ، تم العثور على ثلاثي الميثيل للهيستون 3 ليسين 27 (H3K27me3) أو H3K9me3 في المناطق غير المتجانسة حيث يتم كبح نشاط الجين أو "صامت". على النقيض من ذلك ، يرتبط H3K4me3 أو H3K36me3 بمناطق متجانسة اللون حيث تنشط الجينات [68،69].

العلاقة بين السرطان وتنظيم الكروماتين موثقة جيدًا [70]. تحدث غالبية الطفرات السرطانية في جينات معدِّلات الكروماتين [71-73] ، والتي تشمل عددًا من الجينات الكابتة للورم ، مثل SIRT1 [74]. عدم الاستقرار الجيني هو السمة المميزة للسرطان ونتيجة للتغييرات في الهيتروكروماتين التي تعطل الإسكات [75،76]. ديليجيزر وآخرون. تحليل PTMs هيستون على الجسيمات النووية المنتشرة في البلازما [22]. في ضوء الدليل على إلغاء تنظيم PTMs القمعية المرتبطة بإسكات الجينات في السرطان ، تم تقييم مثيلة الهيستون ، وتحديداً H3K9me1 ، لأول مرة على الجسيمات النووية المنتشرة من عينات بلازما مرضى المايلوما. حددت أوراق المتابعة انخفاضًا في علامات الكروماتين القمعية (H3K9me3 و H4K20me3 و H3K27me3) في مرضى سرطان القولون والمستقيم وسرطان البروستاتا النقيلي [22،23]. ومع ذلك ، لم تستخدم هذه الدراسات تقنية التسلسل عالية الإنتاجية التي من شأنها أن توفر معلومات عن المواقع الجينية للهيستون PTMs ، وهو جانب مهم يجب مراعاته عند التحديد بين الحالات الفسيولوجية المختلفة (أي الحالات المرضية وغير المرضية) التي تنتج تغييرات في PTM. المستويات في الجسيمات النووية المنتشرة.

سعت دراسة حديثة إلى تقييم تعميم النيوكليوسومات المعدلة بعد التحويلية في مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية باستخدام مزيج من ChIP وتسلسل الجيل التالي [21]. أنشأ المؤلفون سير عمل لعزل النيوكليوسومات المتداولة المعدلة من البلازما وأجروا تسلسلًا عالي الإنتاجية للحمض النووي المرتبط (cfChIP-seq). النيوكليوسومات المعدلة التي تحتوي على PTMs المرتبطة بالجينات النشطة أو رابطة الدول المستقلة- تم استهداف العناصر التنظيمية (أي المعززات) على وجه التحديد: H3K4me1 / 2/3 و H3K36me3. تم استخدام إشارة H3K4me3 cfChIP-seq كبديل للجينات النشطة ولخصت النتائج السابقة التي تفيد بأن برامج تنشيط الجينات الخاصة بنوع الخلية تنتمي بشكل أساسي إلى سلالات الدم في فرد سليم. علاوة على ذلك ، عكست إشارات cfChIP-seq إشارات ChIP-seq المحددة مسبقًا لـ PTM في هذه السلالات.

تم توسيع هذا التحليل لتشخيص المرضى الذين يعانون من مجموعة متنوعة من الإهانات الفسيولوجية ، بما في ذلك الجراحة والسرطان. اكتشف cfChIP-seq اختلافات في التعبير الجيني لدى الأفراد المصابين بالسرطان مقارنة بالأفراد الأصحاء. استجابة للتدخلات الجراحية ، كان من الممكن اكتشاف التغييرات في توقيعات cfChIP الخاصة بالأنسجة في دم المرضى الذين يدعمون خصوصية الأنسجة الأصلية. تم أيضًا تقييم مجموعات من PTMs للحصول على معلومات تكميلية لمزيد من النشاط الجيني الخاص بنوع الأنسجة من مناطق غير مشفرة. لاحظ المؤلفون تغيرات في H3K4me2 (وجدت في عناصر مُحسِنة مفترضة) و H3K36me3 (وجدت داخل جسم الجينات المنسوخة) التي ارتبطت بنشاط الجينات التفاضلية الفريدة لأورام السرطان. بشكل عام ، فإن القدرة على تحديد أنسجة المنشأ بناءً على إثراء PTMs النوكليوزومية المتداولة المرتبطة بالنسخ في مناطق معينة من الجينوم أمر مثير. يوفر تسلسل cfChIP طبقة إضافية من المعلومات حول الحالة الفسيولوجية الأساسية للفرد المشتقة من الدم.

10. تحدد أنماط مثيلة الحمض النووي الخالية من الخلايا الأنسجة الأصلية

ترتبط مثيلة السيتوزينات في سياق CpG ثنائي النوكليوتيد بالهوية الخلوية [77] ويمكن التعرف عليها على cfDNA [78،79]. إن نزع الأمين من السيتوزين إلى اليوراسيل باستخدام ثنائي كبريتات الصوديوم أو استخدام جسم مضاد خاص بـ CpG methylation إلى الحمض النووي الميثلي المنسد هما الطريقتان الرئيسيتان المستخدمتان لرسم خريطة جينوم مثيلة CpG على نطاق واسع. غالبًا ما يرتبط فرط الميثيل المحفز للجين بإسكات [79]. ملفات تعريف مثيلة الحمض النووي مستقرة ومحددة من نوع الخلية ، وقد تم استخدام المناطق الميثيلية التفاضلية (DMRs) على نطاق واسع في القياس الكمي للمجموعات السكانية الفرعية في الحمض النووي المستخرج من مجموعات الخلايا غير المتجانسة [80،81]. أكوماندو وآخرون. أظهر أن أنواع الخلايا في الكريات البيض يمكن قياسها كميًا باستخدام حالة المثيلة في أقل من 20 موقع CpG [82]. تُظهر العديد من المواقع الجينومية مثيلة الحمض النووي عالية النوعية من النوع الخلوي ، والتي كانت مفيدة في تطوير طرق حسابية لتحديد مساهمة الأنسجة في cfDNA. جزر CpG ، وهي منطقة بطول 300-3000 سنة مضت وغنية بمحتوى G + C ، عادة ما تكون ناقصة الميثيل ، لكن الميثلة الشاذة لهذه المناطق ترتبط بأمراض مثل السرطان [83]. تشترك بعض جزر CpG في مستويات مثيلة عالية عبر أنواع الأورام ، في حين أن البعض الآخر خاص بالورم [84]. يعتبر فرط الميثيل المروج للجينات الكابتة للورم سمة مميزة للأورام خاصة أثناء التسرطن [85،86]. تم استخدام التضخيم المستهدف لمناطق المروج المرشحة لإيجاد أن cfDNA من مرضى السرطان يظهرون فرط ميثيل على عكس المتبرعين الأصحاء [87-89]. باستخدام الترسيب المناعي للحمض النووي الميثلي (MeDIP-seq) المُحسَّن لكميات الحمض النووي المنخفضة ، شين وآخرون. اكتشف العديد من DMRs في cfDNA من أفراد مصابين بالسرطان خاصة بنسيج الورم الأصلي [90]. على وجه الخصوص ، أظهروا أن DMRs البلازما في الأفراد المصابين بسرطان القولون والمستقيم تتطابق بشكل وثيق مع DMRs المشتقة من الورم الصلب. وهكذا ، يمكن استخدام أنماط الميثلة الخاصة بالأنسجة و hypermethylation للجينات الكابتة للورم كتوقيعات للكشف عن السرطان وكذلك تحديد أنسجة (أنسجة) cfDNA من الأصل [91].

11. الخلاصة / آفاق المستقبل

الملاحظة الرائعة في عام 1970 والتي ألمحت إلى وجود علاقة بين الحمض النووي السيتوبلازمي وبنية الكروماتين للخلية الأصلية ، تكمن الآن وراء النموذج المفاهيمي لعلم الوراثة اللاجينية cfDNA [18]. نظرًا لوجود وعي متزايد بالقيود المرتبطة باكتشاف الأمراض وتحديدها ، مثل السرطان ، استنادًا فقط إلى الأنماط الجينية الطافرة ، فإن ظهور نهج cfDNA القائمة على علم الوراثة يوفر بديلاً قيمًا (الشكل 2). غالبًا ما يتم اختلال نظم إعادة تشكيل الكروماتين ، والمجمعات المعدلة للكروماتين ، وناقلات ميثيل الحمض النووي في السرطان ، مما يبرز العلاقة بين تنظيم الكروماتين وتكوين الأورام [92-97]. علاوة على ذلك ، تُظهر عمليات المحاكاة أن استخدام المئات من الميزات في جميع أنحاء الجينوم (والذي سيكون هو الحال بالنسبة للسمات اللاجينومية) يحسن حد اكتشاف الحالات المرضية من cfDNA مقارنة ببعض الميزات (وهو ما سيكون عليه الحال عند البحث عن طفرات الورم) [ 49،90]. قد يؤدي الجمع بين التقييمات اللاجينومية والاستهداف القائم على الطفرات إلى توجيه العلاج المخصص لمرضى السرطان بشكل أفضل بدلاً من الاعتماد فقط على طريقة واحدة.

الشكل 2. التطبيقات السريرية لمرضى السرطان باستخدام السمات اللاجينومية للحمض النووي الخالي من الخلايا.

لا يزال الاكتشاف المبكر للسرطان يمثل تحديًا لجميع الأساليب القائمة على cfDNA. يزيد التشخيص المبكر للسرطان من فرصة المريض في العلاج العلاجي. ومع ذلك ، فإن إفراز الورم للحمض النووي في الدم يكون بتركيز أقل في المراحل المبكرة مما لوحظ في مراحل السرطان المتقدمة. تم استخدام معظم الطرق الموضحة أعلاه على عينات من مرضى السرطان المتقدمين مما يشير إلى بذل جهد مطلوب بشدة لفحص استخدامها وحساسيتها للكشف المبكر. ومع ذلك ، يتم إجراء عدد كبير من الطرق الداخلية. استخدمت دراسة عشوائية متعددة المراكز مؤخرًا تحليل مثيلة cfDNA للتقييم المستقبلي لأكبر مجموعة (ن = 6689 ، 4207 صحي و 2482 سرطان) حتى الآن للكشف المبكر وتوطين أكثر من 50 نوعًا من السرطانات [91]. بنسبة دقة تصل إلى 99.3٪ ، زادت الحساسية مع زيادة مرحلة السرطان (المرحلة الأولى: 18٪ - المرحلة الرابعة: 93٪) ، مع توقع أنسجة المنشأ بالسرطان في 96٪ من العينات بدقة 93٪. هذه نتائج واعدة للتطوير المستقبلي لاختبار فحص السرطان لعامة السكان. مع التحسينات بمرور الوقت ، يمكن دمج طرق cfDNA epigenomic الموصوفة في هذه المراجعة مع الممارسات السريرية الحالية لتحسين اكتشاف السرطان لدى المرضى.

الحصول على التوقيعات الجزيئية للسرطان على أساس السمات اللاجينومية يسلط الضوء على مجموعة متنوعة من المعلومات الموجودة في دم الفرد. تمثل الدراسات التي استعرضناها هنا شبكة متعامدة من المعلومات اللاجينومية الخاصة بالأمراض والغنية بالاستغلال. بالاقتران مع التشخيص الجزيئي السريري الحالي ، فإن الظهور في الوقت المناسب لطرق الحمض النووي الوراثي فوق الجينوم يبشر بفرصة لإحداث ثورة في إدارة المرض ، وخاصة السرطان. يمكن للمرء أن يتصور التنفيذ الناجح لهذه الأساليب للمساعدة في توجيه الطب الشخصي في مراحل مختلفة من المرض بدءًا من التشخيص وطوال فترة العلاج. بالإضافة إلى المؤشرات الحيوية ، توفر منهجيات الـ cfDNA اللاجينومية المتنوعة أيضًا فرصة للتحقيق المباشر في الآليات الجزيئية الكامنة وراء علم الأمراض لدى البشر.


على الرغم من كل تعقيدها وتنوعها الغني للأنماط الظاهرية الخلوية المكونة ، يمكن وصف الكائنات متعددة الخلايا بأساس مشترك - جينومها. مع مشاركة جميع خلايانا في نفس الشفرة الجينية ، يعمل تنظيم التعبير الجيني كجذر لعدم التجانس في الهوية الخلوية والاستجابة والدور. بالنظر إلى جميع المعلومات (الشكل والوظيفة والتطور من خلية واحدة وما إلى ذلك) التي يجب ترميزها في الجينوم البشري ، فربما لا يكون من المفاجئ أن يكون الجينوم البشري ثنائي الصبغيات طويلًا جدًا ، ويمتد على 6 مليارات زوج قاعدي. امتد من طرف إلى طرف ، فإن الحمض النووي في كل خلية جسدية بشرية ثنائية الصبغة سيقيس ما يقرب من 2 متر ، ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تخزين فعال من حيث المساحة للحمض النووي ينتج عنه ضغطه بأوامر من الحجم ليتناسب داخل نوى صغيرة أقل من 10 ميكرومتر في القطر (Greeley، Crapo، & Vollmer، 1978 Piovesan et al.، 2019). على الرغم من هذا الضغط ، يجب أن يكون الحمض النووي متاحًا بشكل ديناميكي للسماح بتنشيط الجينات وتنظيمها وتكرارها بينما تنمو الخلية وتنقسم وتستجيب للمنبهات. تحدد هذه الاعتبارات التحديين المتناقضين على ما يبدو لتنظيم الكروماتين: تغليف الحمض النووي بحيث يتلاءم مع الخلية مع الاحتفاظ بإمكانية الوصول الكافية للعمليات الضرورية لوظائف الخلية.

بحثًا عن القوى التي تدير توازن العبوة مقابل إمكانية الوصول الوظيفية ، تعمق الباحثون في استكشاف الجينوم الخطي في السبعينيات. بشرت ثورة الحمض النووي المؤتلف بتطوير تقنيات تجريبية جديدة لعلم الوراثة الجزيئي (على سبيل المثال ، عزل الجينات للدراسة) ، وتم تسلسل الجينات لأول مرة (Lis ، 2019). بحلول الثمانينيات والتسعينيات من القرن الماضي ، اكتشف العلماء عددًا لا يحصى من العوامل المرتبطة ببدء النسخ والتنظيم في الأشكال التنظيمية القريبة من الجين المعني (لامبرت وآخرون ، 2018 رويدر ، 2019). ومع تعمق فهمنا لتعقيد تنظيم النسخ ، أصبح من الواضح أن العناصر التنظيمية القريبة ليست سوى جزء واحد من المشهد التنظيمي الأوسع. بدأ موضوع الجينوم ثلاثي الأبعاد والتنظيم البعيد للنسخ يحظى باهتمام أكبر حيث حدد الباحثون العناصر التنظيمية التي يطلق عليها معززات الآلاف إلى الملايين من أزواج القواعد البعيدة عن الجينات المستهدفة (سبيتز ، 2016). على سبيل المثال ، تم تطوير اختبار ربط نووي في عام 1993 بفحص الفئران البرولاكتين الجين وأفادت بأن المحسن البعيد ومناطق المروج القريبة متجاورة مكانيًا ، وهو تفاعل يحفزه يجند الاستروجين الذي يعمل على مستقبلات هرمون الاستروجين المرتبط بالمُحسِّن البعيد (Cullen، Kladde، & Seyfred، 1993 Gothard، Hibbard، & Seyfred، 1996). بالنظر إلى الدور المركزي الذي يلعبه التعبير الجيني في النمط الظاهري للخلية وظهور المرض ، فإن تفريغ التداعيات الوظيفية لهذه التفاعلات الجينية البعيدة يحمل وعدًا كبيرًا لتعزيز فهمنا للجينوم ، وبالتالي أصبح الدافع لتطوير تقنيات التقاط التشكل الصبغي. . في هذه المراجعة ، قمنا بتأريخ التطورات الرئيسية في تقنية التقاط تشكل الكروموسوم والرؤى البيولوجية التي أعطاها لنا تطبيقها ، مع إيلاء اهتمام خاص لطريقة Micro-C التي تم تطويرها مؤخرًا.


الحمض النووي العملاق البالغ من العمر مليون عام يحطم الرقم القياسي

حطم العلماء للتو الرقم القياسي لأقدم حمض نووي تم تسلسله على الإطلاق - باستخدام بعض أسنان الماموث التي يزيد عمرها عن مليون عام.هذا وقت طويل ، في الواقع ، أن الحمض النووي في الداخل قد تكسر في الغالب إلى قصاصات صغيرة ، لا يمكن تمييز الكثير منها الآن على أنها من الماموث. ولكن بفضل بعض التقنيات المذهلة ، لم يقم Love Dalénand زملاؤه بتجميع القصاصات معًا فحسب ، بل اكتشفوا أيضًا جزءًا من شجرة عائلة الماموث ، بالإضافة إلى بعض التلميحات حول وقت حصولهم على فراءهم الصوفي. أخبر الحب فيل سانسوم القصة.

الحب - تمكنا من استعادة الحمض النووي من ثلاث عينات من الماموث يزيد عمرها عن مليون عام. وهذا أقدم حمض نووي تم استعادته على الإطلاق.

فيل - هذا ليس فقط أقدم حمض نووي ، أليس كذلك؟ هذا إلى حد بعيد أقدم حمض نووي!

الحب - هذا إلى حد بعيد أقدم حمض نووي تم استعادته حتى الآن. الرقم القياسي السابق ، إذا كنت ترغب في ذلك ، كان عمره حوالي 650 ألف عام. لذلك نحن تقريبا نضاعف هذا الرقم القياسي مع هؤلاء الماموث.

فيل - ما هي العينات في هذه الحالة؟

الحب - كانت العينات عبارة عن أسنان - ضرس - من ثلاثة حيوانات ماموث مختلفة من ثلاث مناطق مختلفة في سيبيريا. تم العثور على هذه العينات بالفعل في السبعينيات من قبل عالم الحفريات الروسي أندريه شير. لقد استغرق الأمر حتى عام 2017 حتى شعرنا أن لدينا التكنولوجيا والمعرفة للقيام بذلك. كان علينا استخدام طرق جديدة جدًا لتحديد أي من هذه المليارات من تسلسلات الحمض النووي القصيرة التي أنشأناها جاءت بالفعل من الماموث.

فيل - وماذا وجدت بالداخل؟ لأنك قلت أن الحمض النووي. هل كان في قطع قصيرة جدا؟

الحب - ما نراه في البيانات ، بمجرد أن نحصل عليه ، هو أن الحمض النووي يتحلل إلى أجزاء صغيرة للغاية. عادةً ما يكون طول الكروموسوم أكبر بكثير من 100 مليون زوج أو حرف أساسي ، ولكن في هذه الحالة ، يتراوح طول تسلسل الحمض النووي لدينا في المتوسط ​​بين 40 و 50 زوجًا قاعديًا. لذلك يتم تقسيم الجينوم بشكل أساسي إلى عدة ملايين من القطع الصغيرة. ونرى أيضًا أن الغالبية العظمى من الحمض النووي في هذه العينات ليست من الماموث ، بل هي من البكتيريا ، وهناك أيضًا الحمض النووي من النباتات في الرواسب وهناك الحمض النووي من البشر. تخيل أن لديك لغزًا به ملايين أو حتى مليارات القطع الصغيرة التي يجب عليك تجميعها معًا ، وكل ما علينا فعله هو غطاء الصندوق. وفي حالتنا ، هذا هو الجينوم المرجعي للفيل الأفريقي. لكن المشكلة هنا هي أنه ليس لدينا أحجية واحدة فقط ، بل لدينا في الواقع 10 ألغاز مختلفة ، حيث تم خلط القطع معًا. والتحدي هنا هو العثور على القطع التي تنتمي إلى واحدة فقط من تلك الألغاز ، ثم وضعها معًا بالترتيب الصحيح.

فيل - هل تمكنت من ذلك رغم ذلك؟ هل حصلت على أحجية الصور المقطوعة الكاملة المصممة لكل من هذه الأسنان الثلاثة؟

الحب - نعم ولا. تمكنا من تجميع الألغاز كما كان من الممكن القيام بها ، ولكن فقط لواحد من هؤلاء الماموث لدينا كل القطع في اللغز. بالنسبة للاثنين الآخرين ، لدينا جينومات جزئية ، ولكن من نوع منظور الجينوم السكاني ، لا يهم حقًا أن لدينا بيانات كافية من كل فرد حتى نتمكن من قول شيء ما عن تاريخ سكانهم وعلاقتهم بالآخرين الماموث.

فيل - حسنًا ، هل كانوا جميعًا أنواعًا مختلفة جدًا من الماموث؟

الحب - حسنًا ، جاء أحدهم لدهشتنا من نوع غير معروف سابقًا من الماموث لم نكن نعلم بوجوده. نشير إليه على أنه نسب Krestovka.

الحب نعم. كانت العينة الثانية في الواقع ما توقعنا أن نجد توقعنا هو أن هذا سيكون سلف كل الماموث الصوفي ، وهذا ما وجدناه بالفعل. والعينة الثالثة مثيرة للاهتمام أيضًا لأنها أصغر قليلاً ، عمرها حوالي 700000 عام ، وهي في الواقع واحدة من أوائل الماموث الصوفي المعروف.

فيل - هل لديك أي فكرة عن شكل هذه المجموعة الضائعة من الماموث؟

الحب - لا ، لم نحصل على ما يكفي من البيانات الجينومية لنقول أي شيء فعليًا عن نوع المظهر الجسدي حول ماموث Krestovka. لقد حصلنا على بيانات كافية من الماموث الآخر البالغ من العمر مليون عام ، والذي كان سلف الماموث الصوفي. هذا هو على الأرجح ما نشير إليه باسم الماموث السهوب. قبل هذه الدراسة ، لم يكن معروفاً بعض الشيء كيف تبدو ، لأن ما لدينا هو عظام وأسنان وما إلى ذلك منها ، وأنياب. لذلك علمنا أنها كانت كبيرة - كانت أكبر بكثير من الماموث الصوفي - ولكن ما يمكننا رؤيته الآن هو أنه يبدو أنها كانت تمتلك تقريبًا كل هذه التكيفات الباردة التي نراها أيضًا في الماموث الصوفي. كان لديهم فراء صوفي ، تكيفات من أجل التنظيم الحراري ، وربما كان لديهم أيضًا هذا المتغير الجيني الذي جعلهم أقل حساسية لدرجات الحرارة الباردة ، وهو ما نراه أيضًا في الماموث الصوفي.

فيل - أستمر في العودة إلى رقم المليون عام. هل سنستمر في رؤية هذه التواريخ تذهب إلى أبعد من ذلك؟ أم أنه ، أطلق عليه اليوم ، مليون - لقد انتهينا!

الحب - لا أعتقد أننا انتهينا على الإطلاق. أعني ، يمكننا أن نرى في البيانات أن العينات قريبة من الحد الأقصى ، لكنها ليست في الحد الأقصى. لذلك نحن نعلم بناءً على هذه البيانات أنه يمكننا العودة بالزمن إلى الوراء. السؤال هو إلى أي مدى. تقول هذه النماذج النظرية بشكل أساسي أنه لا يوجد حمض نووي على الإطلاق ، والحد هناك ما يقرب من 7 ملايين سنة. لكن عند هذا الحد ، سيتم تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء صغيرة جدًا ، مثل بضعة أزواج أساسية ، ولا يمكننا العمل مع ذلك ، لأنه لا يمكنك إثبات أنه يأتي من الحيوان المعني. لذا فإن السؤال الحقيقي هو: إلى أي مدى يمكن أن نذهب إلى الوراء ، وما زلنا قادرين على تحديد هذه الأجزاء على أنها من الماموث أو أي حيوان نقوم بتحليله؟ أعتقد أنه يمكننا تجاوز 2 مليون.


شاهد الفيديو: من معجزات الطبيعة. كيف يحكي لنا الحمض النووي تاريخ البشر والكائنات المنقرضة (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Sumertun

    الرد السريع ، سمة البراعة ؛)

  2. Virr

    عذرا ، لا يمكنني المشاركة الآن في المناقشة - إنها مشغولة للغاية. لكنني سأعود - سأكتب بالضرورة ما أفكر به في هذا السؤال.

  3. Elgine

    انت لست على حق. أنا متأكد. أقترح مناقشته. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM.

  4. Khristos

    انت لست على حق. سوف نناقش. اكتب في PM ، وسوف نتواصل.

  5. Halig

    مبروك ، فكرتك جيدة جدا



اكتب رسالة