معلومة

6.8.2: عد الخلايا القابلة للتطبيق - علم الأحياء

6.8.2: عد الخلايا القابلة للتطبيق - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يستخدم العد الصفائح لتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في العينة.

أهداف التعلم

اشرح عد الخلايا القابل للتطبيق

النقاط الرئيسية

  • تعتمد لوحة الانتشار على البكتيريا التي تنمو مستعمرة على وسط غذائي بحيث تصبح المستعمرة مرئية بالعين المجردة ويمكن حساب عدد المستعمرات الموجودة على الطبق.
  • يمكن استخدام الوسائط الانتقائية لتقييد نمو البكتيريا غير المستهدفة.
  • يتم استخدام طريقة لوحة الصب عندما يبحث التحليل عن الأنواع البكتيرية التي تنمو بشكل سيئ في الهواء ، على سبيل المثال عينات المياه.

الشروط الاساسية

  • العد لوحة: وسيلة لتحديد عدد الخلايا النشطة في العينة.

عد الخلايا القابلة للحياة

توجد عدة طرق لتعداد عدد البكتيريا في العينة. يسمح عدد الخلايا القابلة للحياة للشخص بتحديد عدد الخلايا النشطة / المنقسمة في العينة. تعتمد طريقة عدد الصفائح أو لوحة الانتشار على البكتيريا التي تنمو مستعمرة على وسط غذائي. تصبح المستعمرة مرئية للعين المجردة ويمكن حساب عدد المستعمرات على الصفيحة. لكي تكون فعالة ، يجب ترتيب تخفيف العينة الأصلية بحيث يتم زراعة ما بين 30 و 300 مستعمرة من البكتيريا المستهدفة في المتوسط. أقل من 30 مستعمرة تجعل التفسير غير سليم إحصائيًا ، وغالبًا ما ينتج عن أكثر من 300 مستعمرة تداخل المستعمرات وعدم الدقة في العد. لضمان إنشاء عدد مناسب من المستعمرات ، يتم عادة استزراع العديد من التخفيفات. يتضمن الإجراء المختبري إجراء تخفيفات متسلسلة للعينة (1:10 ، 1: 100 ، 1: 1000 وما إلى ذلك) في ماء معقم وزراعتها على أجار المغذيات في طبق مغلق ومحتضن. تشمل الوسائط النموذجية أجار عدد الصفائح للتعداد العام أو أجار MacConkey لعد البكتيريا سالبة الجرام مثل الإشريكية القولونية. عادةً ما يتم تحضين مجموعة واحدة من اللوحات عند 22 درجة مئوية ولمدة 24 ساعة ومجموعة ثانية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. عادةً ما يشتمل تكوين المغذيات على الكواشف التي تقاوم نمو الكائنات غير المستهدفة وتجعل من السهل التعرف على الكائن المستهدف ، غالبًا عن طريق تغيير اللون في الوسط. تتضمن بعض الأساليب الحديثة عامل الفلورسنت بحيث يمكن أتمتة عد المستعمرات. في نهاية فترة الحضانة ، تُحسب المستعمرات بالعين ، وهو إجراء يستغرق بضع لحظات ولا يتطلب مجهرًا لأن المستعمرات عادة ما يكون عرضها بضعة ملليمترات.

يتم استخدام طريقة لوحة الصب عندما يبحث التحليل عن الأنواع البكتيرية التي تنمو بشكل سيئ في الهواء. يتم إجراء التحليل الأولي عن طريق خلط التخفيفات المتسلسلة للعينة في أجار المغذيات السائلة ثم يتم سكبها في زجاجات. يتم بعد ذلك إحكام غلق الزجاجات ووضعها على جوانبها لإنتاج سطح أجار مائل. يمكن حساب المستعمرات التي تتطور في جسم الوسط بالعين بعد الحضانة. يُشار إلى العدد الإجمالي للمستعمرات باسم العدد الإجمالي القابل للتطبيق (TVC). وحدة القياس هي cfu / ml (أو وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر) وتتعلق بالعينة الأصلية. حساب هذا هو مضاعف عدد المستعمرات المحسوب مضروبًا في التخفيف المستخدم. أمثلة على عدد الخلايا القابلة للحياة هي اللوحات المنتشرة من التخفيف المتسلسل للثقافة السائلة وصب الألواح. باستخدام لوحة الانتشار ، يقوم المرء بعمل تخفيفات متسلسلة في الوسائط السائلة ثم ينشر حجمًا معروفًا من الأنبوب الأخير في سلسلة التخفيف. يمكن بعد ذلك حساب المستعمرات الموجودة على اللوحة ويمكن حساب تركيز البكتيريا في الثقافة الأصلية. في طريقة لوحة الصب ، يتم خلط عينة بكتيرية مخففة مع أجار ذائب ثم يُسكب هذا الخليط في طبق بتري. مرة أخرى سيتم حساب المستعمرات وحساب عدد الخلايا القابلة للحياة.


تقنيات علم الأحياء الدقيقة الفموي

2.4.1.2 الطرق

تُستخدم طرق قياس التعكر وطرق العد القابلة للتطبيق بشكل شائع لتحديد منحنى النمو.

قياس التعكر: بعد التلقيح ، قم بقياس الكثافة البصرية (OD) لثقافة الخلية أثناء الزراعة. ارسم منحنى النمو باستخدام قيمة OD كمحور Y ووقت الزراعة كمحور X.

طريقة العد قابلة للتطبيق: في أبحاث علم البيئة الميكروبية ، يعكس عدد الخلايا القابلة للحياة التغيرات الديناميكية في نمو البكتيريا. بشكل عام ، يتم طلاء الخلايا ويتم عد المستعمرات (مزيد من التفاصيل في "طرق قياس وحدات تكوين المستعمرات" أدناه) لقياس عدد الخلايا القابلة للحياة ، وهي الخلايا الوحيدة في المزرعة التي يمكن أن تخضع لانقسام الخلايا والتكاثر. بعد التلقيح وفترة زراعة معينة ، قم بتلقيح حجم معين من ثقافة الخلية على لوحة أجار. ارسم منحنى النمو باستخدام لوغاريتم عدد المستعمرات كمحور ص ووقت النمو كمحور س.


بيولوجيا الخلية

في أبحاث بيولوجيا الخلية ، يشجع التحكم في إجراءات عد الخلايا في المرحلة المبكرة على النتائج القابلة للتكرار. يوصى باستخدام عداد الخلايا الآلي لضمان استخدام أعداد متساوية من الخلايا في التحليل النهائي ، ولتحديد تركيز الخلية بطريقة دقيقة ودقيقة.

حلول

في أبحاث بيولوجيا الخلية ، سواء كنت بحاجة إلى عدد الخلايا والقدرة على البقاء ، أو لإجراء تحليل متقدم للخلايا قائم على التألق بإمكانية استنساخ عالية ، فلدينا حل يناسب احتياجاتك. إن أدواتنا عبارة عن مقاييس خلوية مؤتمتة للصور الفلورية مصممة لسهولة الاستخدام والدقة والدقة.

يعتمد الحصول على بحث عالي الجودة على قابلية استنساخ بياناتك واتساقها. تؤدي أدوات ®NucleoCounter مجموعة واسعة من الوظائف ، بدءًا من العد الدقيق للخلايا وقرارات الجدوى وحتى التحليل المتقدم لعينات الخلايا ، مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم.

تشمل فحوصات التوصيل والتشغيل خمسة فحوصات مختلفة لموت الخلايا المبرمج وتحليل دورة الخلية ومقايسة تعداء GFP. بالإضافة إلى ذلك ، يتوفر أيضًا نظام أساسي للمقايسات التي يمكن تحديدها من قِبل المستخدم. تم تصميم أدواتنا لمختبرات البحث والتطوير الخاصة ببيولوجيا الخلية.

عدد الخلايا غير المتحيزة وقرارات الجدوى

يعد العد اليدوي للخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية وطريقة استبعاد المثقبيات الزرقاء مضيعة للوقت ويعتمد بشكل كبير على إدراك المستخدم ومهارات المص.

لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام أدوات NucleoCounter ® NC-202 ™ و NC-3000 ™ ، قم أولاً بتحميل تعليق الخلية في Via2-Cassette ™ أو Via1-Cassette ™ ، على التوالي. يتم تلطيخ الخلايا تلقائيًا بواسطة الفلوروفور في الكاسيت ، أكريدين البرتقالي و DAPI ، مما يؤدي إلى تلطيخ الخلايا الكلية والخلايا الميتة ، على التوالي. يتم معايرة حجم غرفة العد مسبقًا ، مما يضمن الدقة العالية وقابلية التكرار.

حيوية الخلية عالية السرعة والتهم

يتيح NC-Slide A8 ™ متعدد الغرف إمكانية البقاء عالية السرعة وتحديد عدد الخلايا لخلايا الحشرات والثدييات ، وقياس ما يصل إلى ثماني عينات في أقل من ثلاث دقائق. مزيج تعليق الخلية مع البرتقالي أكريدين و DAPI وصمة عار جميع الخلايا والخلايا الميتة ، على التوالي. بعد ذلك ، قم بتحميل غرف A8-slide ™ مع العينة وأدخل الشريحة في NucleoCounter ® NC-3000 ™.

نحن نقدم بروتوكولات عد محسّنة للخلايا المجمّعة والخلايا التي تنمو على ناقلات صغيرة وفي الأجسام الشبه الكروية. اقرأ المزيد حول عدد الخلايا والصلاحية باستخدام NC-Slide A8 ™ لخلايا الثدييات.

تحليل ومرئيات بيانات فائقة

برنامج NucleoView ™ هو واجهة مستخدم لـ NucleoCounter ® NC-200 ™ و NC-3000 ™. يتعامل مع اكتساب البيانات وعرضها ، جنبًا إلى جنب مع تحليل الصور. يشتمل NucleoView ™ على مجموعة متنوعة من ميزات معالجة البيانات المناسبة تمامًا للبيئات المنظمة.

يمكّنك البرنامج من فحص صورة الفلورة بصريًا ويمنحك الفرصة للتحقق من العد. يمكنك تحديد مجموعات حدث معين في مخططات التبعثر وفحص وتحديد صلاحية تضمينها أو استبعادها من نتائج الجرد النهائية. يمكن تعديل البوابة ويمكنك حفظ هذا البروتوكول المعدل للقياسات المستقبلية.

عد الخلايا المجمعة

يتضمن NucleoCounter ® NC-202 ™ (و NC-200 ™) نطاقًا واسعًا من الفحوصات المتخصصة مما يجعله العدّاد الخلوي المثالي. تشكل ثقافات المجال أو أنواع الخلايا شديدة التكتل تحديات كبيرة في تعداد الخلايا ، ولكن مع فحوصاتنا المتخصصة ، يمكن لهذه الأدوات حساب حتى أكثر عينات زراعة الخلايا المجمعة.

فحوصات موت الخلايا المبرمج الموحدة

للبحث المتقدم في موت الخلايا ، من الضروري دراسة آليات موت الخلايا المبرمج. باستخدام NucleoCounter ® NC-3000 ™ ، سلسلة من خمسة فحوصات التوصيل والتشغيل بما في ذلك Annexin V ، وإمكانات الميتوكوندريا مع JC-1 ، وإشارات caspase ، وتجزئة الحمض النووي وفحص الحيوية الفريد لمدة دقيقة واحدة ، مما يتيح لك فحص الخلية بشكل كامل آليات الموت.

فحص ترقق العين الكشف عن التغيرات الفسيولوجية المسرح
فحص إمكانات الميتوكوندريا (JC-1) انهيار إمكانات غشاء الميتوكوندريا مبكرا
أنكسين الخامس الفحص انهيار عدم تناسق الدهون في غشاء البلازما أوائل منتصف
فحص Caspase يشير تنشيط Caspase إلى أحداث موت الخلايا المبرمج في اتجاه مجرى النهر أوائل منتصف
فحص الحيوية (VB48 ™) انخفاض في المستويات الخلوية للثيولز المختزل ، على سبيل المثال. GSH متأخر
فحص تجزئة الحمض النووي تفكك وتفتيت الحمض النووي متأخر

تغطي هذه الاختبارات المراحل المبكرة إلى المتأخرة من موت الخلايا المبرمج ، وتساعدك على إجراء دراسات متعمقة لتطور موت الخلايا المبرمج في خلايا الثدييات. يمكنك إجراء تحليل بيانات متقدم دون عناء باستخدام NucleoView ™. يقدم النظام الأساسي روابط بين الصور والرسوم البيانية ومخططات التشتت ، مما يتيح لك الوصول إلى تحليل بيانات مفصل ودقيق يحدد النسب المئوية للخلايا الحية والنخرية والموتية.

مراقبة الجدوى وفعالية تعداء GFP

عند نقل الخلايا ذات الجينات ذات الاهتمام ، تتمثل إحدى طرق تحديد كفاءة تعداء الخلايا في التعبير المشترك عن بروتين الفلورسنت ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت نفس المروج وتحديد كمية GFP.

يوفر NucleoCounter ® NC-3000 ™ اختبارًا سريعًا وسهل الاستخدام لاختبار كفاءة تعداء GFP ومستويات التعبير. من خلال تلطيخ الخلايا باستخدام Hoechst 33342 و propidium iodide (PI) ، يمكنك تحديد إجمالي عدد الخلايا ومجموع الخلايا الميتة مع السكان الذين يعبرون عن GFP.

تلطيخ الخلايا في برنامج NucleoView ™ باستخدام مقايسة كفاءة تعداء GFP باستخدام NucleoCounter ® NC-3000 ™

توجد خلايا A & # 8211 باستخدام Hoechst 33342 (أزرق) ويمكن بسهولة تحديد النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن GFP (باللون الأخضر). تلطخ الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام يوديد البروبيديوم (أحمر PI).
B & # 8211 يتم تحديد جميع الخلايا الملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق).
يتم تحديد الخلايا المعبرة عن C & # 8211 GFP في خلايا خضراء وغير قابلة للحياة باللون الأحمر بواسطة تلطيخ PI.

يتيح لك الاقتران السهل بين الصورة التي تم الحصول عليها والمخططات المبعثرة أو الرسوم البيانية تحديد إعدادات البوابة الدقيقة المستخدمة للتحقق من نمط التلوين لمجموعات خلايا معينة. يوفر NucleoCounter ® NC-3000 ™ نظامًا أساسيًا متعدد الإمكانات لتقييم كفاءة تعبير GFP.

يمكن تحديد موقع الخلايا غير القابلة للحياة الملطخة بـ PI بسهولة باستخدام وظيفة تراكب الصور في برنامج NucleoView ™ (A). يمكن تحديد الخلايا المنقولة GFP على الفور (ب).

تحليل دورة الخلية السريعة

يعد التحقيق في تأثير العلاج على انقسام الخلايا أحد أقوى الأدوات في بيولوجيا الخلية. يوفر NucleoCounter ® NC-3000 ™ تحليلًا سريعًا وسهلاً لدورة الخلية في أقل من خمس دقائق.

بعد إضافة محلول تحلل ، يتم صبغ جميع نوى الخلية ، ويتم قياس العينة باستخدام NC-3000 ™. يتم عرض ملف تعريف دورة الخلية في Plot Manager المصاحب في برنامج NucleoView ™. يتم تحديد الأحداث في المرحلة الفرعية G1 ، المرحلة G0 / G1 ، المرحلة S و G2 / M- المرحلة.

مع حزمة برنامج FlexiCyte ™ ، يمكن استخدام NucleoCounter ® NC-3000 ™ لدراسة تكاثر الخلايا مع دمج BrdU و EdU ، الذي تم اكتشافه باستخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامات الفلورسنت مما يسمح بإجراء دراسات متقدمة حول تكاثر الخلايا.

رسم توضيحي: فحص دورة الخلية المكونة من خطوتين لخلايا Jurkat غير المعالجة والكامبتوثيسين (CPT). تعرض الرسوم البيانية شدة DAPI لوصمة الحمض النووي ويمكن استخدامها لتحديد أحداث دورة الخلية في المرحلة الفرعية G1 و G0 / G1 و S-phase و G2 / M-phase. بعد علاج CPT ، يتم إيقاف دورة الخلية في المرحلة G2 / M.

تحليل الخلايا المتقدم

تتيح وحدة FlexiCyte ™ المتوفرة لجهاز NucleoCounter ® NC-3000 ™ للمستخدمين إجراء تحليل خلوي تفصيلي متقدم من اختيارهم في خلايا الثدييات والحشرات. تتيح لك مجموعة مصابيح LED ، من الأشعة فوق البنفسجية إلى اللون الأحمر البعيد ، جنبًا إلى جنب مع مجموعة مختارة بعناية من مرشحات الانبعاث ، اكتشاف مجموعة واسعة من البروتينات والأجسام المضادة الفلورية.

تقوم ميزة معالج التكيف بالبروتوكول بتوجيه المستخدم من خلال مجموعة مختارة من الإعدادات المثلى. بعد الحصول على الصورة ، في Plot Manager ، يتم تقديم بيانات الخلية بجانب صورة الفلورسنت إما كمخططات مبعثرة أو مدرج تكراري أو كليهما. من خلال ربط الصور بالمخططات ، فأنت مسلح بكل ما تحتاجه لإجراء تحليلات مفصلة للبيانات.

تتيح حزمة برامج FlexiCyte ™ تحليل العلامات الحيوية المفصل لمجموعة واسعة من البروتينات والأجسام المضادة الفلورية.


إجراء

    الحصول على تعليق موحد للخلايا: اتبع بروتوكول تحييد الكتابة / التربسين لنوع الخلية المحدد. ضع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم مناسب. للحصول على تعداد دقيق للخلايا ، من الضروري وجود تعليق موحد يحتوي على خلايا مفردة. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل في الأنبوب 5-7 مرات باستخدام ماصة مع تجويف صغير (5 مل أو 10 مل ماصة). بالنسبة للخلايا التي تم إذابتها من الحفظ بالتبريد (في وسط 1 مل من الحفظ بالتبريد) ، استخدم الماصة لأعلى ولأسفل 7-10 مرات باستخدام ماصة مل واحدة.

لتحديد دقيق ، يجب أن يكون العدد الإجمالي للخلايا التي تعلو 1 مم 2 بين 15 و 50. إذا كان عدد الخلايا لكل 1 مم 2 يزيد عن 50 ، خفف العينة وعد مرة أخرى. إذا كان عدد الخلايا لكل 1 مم 2 أقل من 15 ، فاستخدم عينة أقل تمييعًا. في حالة عدم توفر عينات أقل تمييعًا ، قم بحساب الخلايا على جانبي مقياس الهيموسيتومتر (مناطق 8 × 1 مم 2).

احتفظ بعدد منفصل من الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. إذا كانت أكثر من 25٪ من الخلايا غير قابلة للحياة ، فلن يتم الحفاظ على الثقافة على الكمية المناسبة من الوسائط. أعد احتضان الثقافة وضبط حجم الوسائط وفقًا لالتقاء الخلايا وظهور الوسائط. قم بتضمين الخلايا في الأعلى واليسار التي تلامس الخط الأوسط. لا يتم حساب الخلايا التي تلامس الخط الأوسط في الأسفل واليمين.

أنا. التريبان الأزرق هو "البقعة الحيوية" المستبعدة من الخلايا الحية.
ثانيا. تظهر الخلايا الحية عديمة اللون ومشرقة (قابلة للانكسار) في ظل تباين الطور.
ثالثا. تلطخ الخلايا الميتة باللون الأزرق وهي غير قابلة للكسر.

  • النسبة المئوية لجدوى الخلية = [إجمالي الخلايا القابلة للحياة (غير الملطخة) / إجمالي الخلايا (القابلة للحياة + الميتة)] × 100.
  • خلايا قابلة للحياة / مل = متوسط ​​عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مربع × عامل التخفيف × 10 4 /
  • متوسط ​​عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مربع = إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة في 4 مربعات / 4.
  • عامل التخفيف = الحجم الإجمالي (حجم العينة + حجم السائل المخفف) / حجم العينة.
  • إجمالي الخلايا / العينة القابلة للحياة = الخلايا القابلة للحياة / مل × الحجم الأصلي للسائل الذي تمت إزالة عينة الخلية منه.
  • حجم الوسائط المطلوبة = (عدد الخلايا المطلوبة / إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة) × 1000.

  • معدات الحماية الشخصية (القفازات المعقمة ، معطف المختبر ، قناع الأمان)
  • ضبط Waterbath على درجة الحرارة المناسبة
  • خزانة أمان ميكروبيولوجية بمستوى احتواء مناسب
  • جهاز الطرد المركزي
  • كو2 حاضنة
  • هيموسيتوميتير
  • مجهر الطور المقلوب
  • قوارير معدة مسبقًا
  1. قم بإحضار الخلايا الملتصقة وشبه الملتصقة إلى التعليق باستخدام التربسين / EDTA كما هو موضح سابقًا وأعد التعليق في حجم وسط جديد يعادل على الأقل حجم التربسين. للخلايا التي تنمو في كتل الطرد المركزي وتعيد تعليقها في حجم صغير والماصة برفق لتفتيت الكتل.
  2. تحت ظروف معقمة إزالة 100-200 ميكرولتر من تعليق الخلية.
  3. أضف حجمًا متساويًا من Trypan Blue (عامل التخفيف = 2) واخلطه عن طريق الماصات اللطيفة.
  4. نظف جهاز قياس الكريات.
  5. بلل الغطاء بالماء أو الزفير. حرك الغطاء على الحجرة ذهابًا وإيابًا باستخدام ضغط خفيف حتى تظهر حلقات انكسار نيوتن (يُنظر إلى حلقات انكسار نيوتن على أنها حلقات تشبه قوس قزح تحت الغطاء).
  6. ملء كلا الجانبين من الغرفة مع تعليق الخلية (حوالي 5-10 ميكرولتر) وعرض تحت مجهر تباين الطور المقلوب باستخدام التكبير x20.
  7. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة (التي تُرى كخلايا ساطعة) والخلايا غير القابلة للحياة (باللون الأزرق الملون). من الناحية المثالية ، يجب حساب خلايا gt100 لزيادة دقة عدد الخلايا (انظر الملاحظات أدناه). لاحظ عدد المربعات التي تم احتسابها للحصول على عدد & gt100.
  8. احسب تركيز الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة والنسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة باستخدام المعادلات أدناه.

الفحص المجهري لمصنع الخمور

هناك مهام أساسية يجب أن يكون كل صانع نبيذ قادرًا على القيام بها باستخدام المجهر. أولاً ، يجب أن تكون قادرًا على التمييز بين البكتيريا والخميرة والفطريات تحت المجهر. ثانيًا ، يجب أن تكون قادرًا على تمييز الكائنات الحية من الحطام (الخلايا النباتية ، البلورات ، عوامل التصفية والتصفية ، إلخ). ثالثًا ، يجب أن تكون قادرًا على تحديد الكائنات الحية الأكثر شيوعًا والتي يمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق البصر حتى تتمكن من معرفة متى تتجه نحو مشكلة. من خلال بعض الخبرة ، ستعرف ما يكفي لتخبرنا أنك لا تعرف ما ينمو في النبيذ وتتخذ إجراءً أو تحصل على المساعدة بسرعة. توجد صور لأكثر أنواع خميرة النبيذ والبكتيريا والعفن شيوعًا مع أوصافها على موقع الويب هذا. أخيرًا ، يجب أن تكون قادرًا على حساب خلايا الخميرة والتمييز بين الخلايا الحية والميتة. هذه هي بعض الأهداف التي نسعى جاهدين لتحقيقها في فصل معمل Wine Microbiology الذي يتم تدريسه في UC Davis.

أنواع الفحص المجهري: هناك أنواع مختلفة من المجاهر المتاحة تتراوح أسعارها من بضع مئات من الدولارات إلى عدة آلاف من الدولارات. عادةً ما يكون النطاق البصري الجيد لمصنع النبيذ أمرًا مرغوبًا فيه ، ويكون النطاق ذو تباين الطور مفيدًا عند النظر إلى البكتيريا. تحتوي معظم المجاهر على 10 أضعاف منظار العين والأهداف من 10x إلى 100x. سيعطيك هذا مدى تكبير من 100x إلى 1000x. في بعض الأحيان ، يمكنك الحصول على عدسات بصرية تبلغ 15 ضعفًا أو 20 ضعفًا يمكنها زيادة التكبير دون الحاجة إلى استخدام هدف 100x. يتطلب أي هدف 100 ضعف الزيت (الغمر بالزيت) لتقليل الانكسار من الضوء الذي ينتقل عبر الهواء بين العينة والهدف. هذا يزيد بشكل فعال من دقة الأجسام تحت المجهر. ستمنحك عدسة بصرية 20x بهدف 40x تكبيرًا كليًا 800x دون استخدام الغمر بالزيت. لكن القرار ليس جيدًا. إلى جانب الأهداف في 10x و 40x و 100x ، قد تحتوي بعض النطاقات على أهداف 4x أو 16x أو 20x أيضًا. يوضح الشكل أدناه خميرة الخميرة متصورة بتكبيرات مختلفة (100x ، 400x ، 1000x).

خميرة الخميرة

100 ضعف 400 ضعف 1000 مرة

يوجد الآن مجاهر رقمية رخيصة للغاية في السوق تستبدل العين بشاشة رقمية مماثلة لما تجده في الكاميرات الرقمية. الأهداف هي نفسها المجهر القياسي ولكن بعض الناس يجدون أنه من الأسهل مشاهدة الشاشة بدلاً من النظر من خلال العين. يسمح النطاق الرقمي بتقريب رقمي يصل إلى 4x ولكن بدون تقريب بصري. يمكن أن يؤدي التقريب الرقمي إلى تشوه الصورة. كما هو الحال مع أي مجهر ، تحدد جودة البصريات جودة الصورة ومعظم المجاهر الرقمية لا تحتوي على أفضل جودة للبصريات. تمتلك أفضل المجاهر الضوئية الآن منفذًا ضوئيًا ثالثًا لإدخال عدسة الكاميرا الرقمية. يسمح ذلك بمشاهدة الصور على شاشة الكمبيوتر. يسهل استخدام الكاميرا الرقمية مشاركة الصور مع الزملاء ويجد بعض المستخدمين أن الشاشة أسهل في الاستخدام من شاشة العين التقليدية.

هناك أيضًا أنواع مختلفة من الفحص المجهري لأغراض محددة. ربما يكون أكثر ما تعرفه هو الفحص المجهري للمجال اللامع ، والذي يستخدم الضوء لإضاءة جسم يمتص الضوء في المناطق الأكثر كثافة لإعطاء تباين للتصور. يستبعد الفحص المجهري للمجال المظلم الضوء غير المتناثر من مجال الرؤية تاركًا الخلفية مظلمة والكائن في مجال الضوء. يستخدم الفحص المجهري الفلوريسنت مصباحًا من الزئبق ومرشحًا لإضاءة مجال الرؤية بضوء بطول موجي محدد. يقوم المرشح الثاني بتصفية هذا الطول الموجي ولكنه يسمح للضوء المنبعث من جزيء متحمس بالمرور عبر العين ويتم تخيله. تحتوي العديد من العينات البيولوجية ، خاصةً تلك التي يتم تركيبها ضوئيًا ، على قدر كبير من التألق الطبيعي ، ولكن عادةً ما تكون العينات ملطخة أو موسومة وراثيًا باستخدام الأصباغ أو الملصقات الفلورية للسماح بتصور الهياكل أو المركبات المحددة في الخلايا. يعد الفحص المجهري لتباين الطور والتداخل التفاضلي (DIC) تقنيات تستخدم لتعزيز تباين الكائنات منخفضة التباين خاصة في العينات غير المثبتة. إن استخدام تباين الطور أو مجهر DIC لعرض البكتيريا يجعل من السهل جدًا على المستخدم عديم الخبرة أن يتخيل بكتيريا صغيرة منخفضة التباين. في حالة تباين الطور المجهري ، يتم تحويل التحولات الطورية في الضوء إلى سطوع في مجال الرؤية مما يسمح برؤية الهياكل الشفافة بشكل طبيعي. يعمل DIC بطريقة مماثلة ولكنه يستخدم قياس التداخل بدلاً من تحولات الطور للسماح بتصور الهياكل غير المرئية في الخلايا. تباين الطور أكثر شيوعًا وأقل تكلفة من مدينة دبي للإنترنت ، لكن العينات المرئية لمدينة دبي للإنترنت تحتوي على هالات ضوئية أقل من عينات تباين الطور. فيما يلي صور Oenococcus oeniباستخدام حقل ساطع عند 400x ، تباين الطور ، و DIC عند 1000x.

Oenococcus oeni

400 ضعف تباين الطور 1000X مدينة دبي للإنترنت 1000X

التفريق بين الخميرة والبكتيريا والعفن: أسهل طريقة للتمييز بين البكتيريا والخميرة (الفطريات أحادية الخلية) والعفن (الفطريات الخيطية) هي عمومًا بالحجم. من السهل رؤية القوالب بتكبير 100 ضعف ، والخميرة بتكبير 400x ، وعادة ما يصعب رؤية البكتيريا إلا إذا ذهبت إلى تكبير 1000 مرة. ومع ذلك ، فإن مقارنة حجم هذه الكائنات يمكن أن يكون صعبًا بدون مرجع. غالبًا ما يكون من الأسهل مزج الثقافات على شريحة مجهر واحدة أو إذا كانت مختلطة بالفعل في عينة التخمير. ولكن هناك بعض الكائنات الحية الشائعة في مصنع النبيذ والتي ليس من السهل تمييزها. يوجد أدناه خليط من بكتيريا التربة الشائعة Bacillus megaterium و أ اكتوباكيللوس من عينة النبيذ. Bacillus megateriumهو أكثر أنواع غير النبيذ شيوعًا عصية التي نجدها في نبيذ كاليفورنيا وكما يوحي اسمها فهي بكتيريا كبيرة جدًا.

Bacillus megaterium و اكتوباكيللوس ص. تكبير 1000X

في حين أن البكتيريا عادة ما تكون أصغر بكثير من الخميرة ، Bacillus megaterium أكبر بكثير من معظم البكتيريا. في الصورة أدناه العملاق B. ينظر إليه بالمقارنة مع خميرة الخميرة. على الرغم من أن الأحجام متشابهة ، فإن البكتيريا أقل قابلية للانكسار وأكثر شفافية ويصعب رؤيتها. هذا هو أيضا نموذجي للبكتيريا مقابل الخميرة. الصورة الثانية من أ شيزوساكارومايسيس الخميرة التي تنقسم بالانشطار بدلاً من البراعم. لأن البكتيريا أيضا تنقسم عن طريق الانشطار ، وهي بكتيريا كبيرة ، مثل العملاق، يمكن أن يخطئ في الخميرة الانشطارية. في الحالة أدناه ، تكون كلتا الصورتين بنفس التكبير ويمكنك أن ترى أن ملف العملاق B. أصغر من الخميرة.

S. cerevisiae و العملاق B. شيزوساكارومايس بومب 1000 مرة

الخمائر أيضًا أصغر حجمًا من القوالب ، وهي خيطية ، في حين أن الخمائر أحادية الخلية. عادةً ما يسهل هذا التمييز بينهما ولكن هناك استثناءات. الأهم من ذلك في بيئة النبيذ هي الخمائر مثل Brettanomyces bruxellensis، هذا الشكل pseudohyphae. يوجد أدناه مقارنة مباشرة بين pseudohyphae من بريتانوميسيس وواصلة منبوتريتيس سينيريا. اللوحة الأولى هي بريتانوميسيس بتكبير 1000x والثاني هو بوتريتيس بتكبير 100 ضعف. البوتريتيس يبلغ حجمها حوالي 10 أضعاف حجم ملف بريتانوميسيس.

Brettanomyces bruxellensis 1000 ضعف بوتريتيس سينيريا 100 ضعف

مثال آخر حيث يصعب تحديد ما إذا كنت ترى خميرة أو عفنًا هو عندما يكون العفن قد شكل جراثيم ورؤية جراثيم فضفاضة. فيما يلي بعض الصور من الخميرة وجراثيم العفن للمقارنة.

Metschnikowia pulcherrima - 400X الرشاشيات النيجر
Saccharomyces bayanus في 1000x بوتريتيس سينيريا جراثيم في 400x maginfication
المبيضات الوسيطة بمعدل 1000 ضعف الفيوزاريوم جراثيم بتكبير 400x

حساب الخميرة القابلة للحياة وغير الصالحة: (راجع أيضًا "عد الخلايا - الإجمالي والقابل للتطبيق") يمكن استخدام مجهر وبعض الأدوات البسيطة لإعطائك فكرة عن رقم الخلية وقابليتها للتطبيق السكريات تلقيح. يمكن استخدام غرفة العد البسيطة المستخدمة لعد خلايا الدم أو الحيوانات المنوية لتحديد عدد الخلايا في حجم معين ويمكن استخدام صبغة الميثيلين الزرقاء لتحديد النسبة المئوية للبقاء في اللقاح. يوجد أدناه صورة للشبكة كما تراها تحت المجهر.

الصورة أعلاه بتكبير 100x والخلايا الموضحة هي خلايا خميرة. المربع الذي يحده 3 خطوط ساطعة هو 0.04 مم مربع ، 25 منها سيكون 0.1 مم مربع أو 0.1 مل في الحجم. عد ما يكفي من المربعات لتعطيك حوالي 100 خلية ثم اقسم عدد الخلايا على عدد المربعات المحسوبة ، واضرب في 25 مربعًا في 0.1 مل ومرة ​​أخرى في 10 لتحصل على عدد الخلايا في 1 مليلتر. يجب أيضًا أن تأخذ في الاعتبار أي تخفيف قمت به في اللقاح الخاص بك عن طريق الضرب في عامل التخفيف لإعطائك عدد الخلايا في عينتك الأصلية.

يمكن استخدام الميثيلين الأزرق لتقدير النسبة المئوية لصلاحية الخلايا في لقاحك. يمكنك شراء محلول أزرق الميثيلين بالتركيز الصحيح لحساب العد. جهز شريحة مجهر بها 5 مايكرولتر من الصبغة و 5 إيول من المحلول. عد 100 خلية مع تتبع عدد الخلايا الزرقاء وعدد الخلايا الواضحة. الخلايا الزرقاء ليست قابلة للحياة ، ولا يمكنها ضخ الصبغة مرة أخرى بعد أن تخترق جدارها الخلوي ، وتكون الخلايا الشفافة قابلة للحياة. الوقت الذي تكون فيه الخلايا في الصبغة مهم. حاول عد الخلايا في حوالي 5 دقائق بعد خلط الصبغة وتعليق الخلية. إذا عدت قريبًا ، فقد لا تكون الصبغة قد دخلت جميع الخلايا. إذا انتظرت طويلاً ، فقد لا تتمكن بعض الخلايا القابلة للحياة من ضخ الصبغة وقد تصبح غير قابلة للحياة. تُظهر الصورة أدناه نفس مجال الرؤية في 2 و 5 و 10 دقائق. (انظر أيضًا "تلطيخ الميثيلين الأزرق")

2 دقيقة 5 دقائق 10 دقائق

التمييز بين الخلايا الحية والديبري: أكبر دليل على ماهية الكائنات البيولوجية وما هو ليس كذلك هو التناظر. يميل الحطام إلى عدم التناسق بينما الكائنات الحية متماثلة. بالطبع العديد من الأشياء التي ستراها أثناء النظر تحت المجهر متناظرة وليست حية ، مثل فقاعات الهواء والبلورات والخلايا الميتة. يمكن التعرف على البلورات بسهولة من خلال شكلها الهندسي وزواياها الحادة. يمكن أن تكون الفقاعات أكثر صعوبة لأنها مستديرة ولكنها تفتقر إلى أي بنية داخلية ويمكن أن تكون بأي حجم. كما أنها تميل إلى النمو مع جفاف الشريحة. قد يكون من الصعب أو المستحيل تمييز الخلايا الميتة عن الخلايا الحية. جزء كبير من الحطام الموجود هو خلايا نباتية وستحتوي على خلايا مرتبطة ببعضها البعض ولكنها ممزقة عند الحواف. غالبًا ما تكون الجسيمات الأخرى التي ستراها أشياء تمت إضافتها إلى النبيذ مثل عوامل التصفية أو التصفية. كانت بعض هذه العوامل حية ذات يوم وقد يُعتقد خطأ أنها خلايا حية ، مثل الدياتومات المتحجرة التي تشكل الأرض المشطورة (DE). فيما يلي بعض الصور لأشياء قد تراها في التخمير والنبيذ الذي ليس على قيد الحياة.


يُعد إجمالي عدد الخلايا جميع الخلايا الميكروبية الحية والميتة في العينة. في المقابل ، فإن تعداد الخلايا القابلة للحياة يعدد الخلايا الحية فقط في العينة. إذن ، هذا هو الفرق الرئيسي بين إجمالي عدد الخلايا وعدد الخلايا القابلة للحياة. العدد الإجمالي للخلايا مستقل عن نمو المستعمرات على ألواح أجار بينما يعد عدد الخلايا القابلة للحياة تقنية قائمة على النمو ويعتمد على نمو المستعمرات الميكروبية على ألواح أجار.

يلخص الرسم البياني أدناه الفرق بين إجمالي عدد الخلايا وعدد الخلايا القابلة للتطبيق.


مقدمة لفحوصات جدوى الخلية

تستخدم فحوصات بقاء الخلية مجموعة متنوعة من الواسمات كمؤشرات للخلايا النشطة الأيضية (الحية). تتضمن أمثلة العلامات المستخدمة بشكل شائع قياس مستويات ATP ، وقياس القدرة على تقليل الركيزة ، واكتشاف الأنشطة الأنزيمية / البروتياز الفريدة للخلايا الحية.

فحوصات جدوى الخلية في الوقت الحقيقي

يقيس RealTime-Glo & trade MT Cell Viability Assay (Cat. # G9711) صلاحية الخلية في الوقت الفعلي. في هذا الاختبار ، تتم إضافة لوسيفيراز هندسيًا وبروسوبسترات (وهي ليست ركيزة من لوسيفيراز) مباشرة إلى وسط الاستزراع. يمكن للركيزة أن تخترق أغشية الخلايا وتدخل الخلايا (الشكل 1). ومع ذلك ، يمكن فقط للخلايا القابلة للحياة مع التمثيل الغذائي النشط أن تقلل من مادة الدعامة إلى ركيزة للوسيفيراز. ثم تخرج الركيزة من الخلية حيث يتم استخدامها بواسطة luciferase في كاشف الكشف لتوليد إشارة الإنارة. يمكن قياس نفس الآبار بشكل متكرر لمدة 3 أيام. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تسمح بمراقبة حركية بسيطة لتحديد استجابة الجرعة باستخدام عدد أقل من اللوحات والخلايا. أيضًا ، نظرًا لأن الطريقة لا تتطلب تحلل الخلايا ، يمكن استخدام نفس الخلايا في الاختبارات الإضافية المستندة إلى الخلايا أو التطبيقات النهائية.

الشكل 1. نظرة عامة على RealTime-Glo & trade MT Cell Biability Assay.

فحوصات جدوى خلايا ATP

يمكن استخدام ATP لقياس صلاحية الخلية لأن الخلايا القابلة للحياة فقط هي التي يمكنها تصنيع ATP. يمكن قياس ATP باستخدام مقايسة قابلية الخلية المضيئة CellTiter-Glo ® (Cat. # G7570) مع الكواشف التي تحتوي على منظف ، وسيفيراز مستقر ، وركيزة لوسيفيرين. يحلل المنظف الخلايا القابلة للحياة ، ويطلق ATP في الوسط. في وجود ATP ، يستخدم luciferase luciferin لتوليد التلألؤ ، والذي يمكن اكتشافه في غضون 10 دقائق باستخدام مقياس الإضاءة (الشكل 2). يتم توفير اختبار CellTiter-Glo® 2.0 (Cat. # G9241) كحل فردي يقلل من وقت تحضير الكاشف ويوفر الراحة في تخزين درجة حرارة الغرفة لسهولة التنفيذ. تعتبر فحوصات ATP أسرع من الطرق الأخرى لأنها لا تتطلب فترات حضانة طويلة لتحويل الركيزة إلى منتج ملون. لديهم أيضًا حساسية ممتازة وخطية واسعة ، مما يجعلها متوافقة للغاية مع التطبيقات عالية الإنتاجية حيث يتم استخدام أرقام الخلايا المنخفضة. كما أنها أقل عرضة للقطع الأثرية من الطرق الأخرى.

الشكل 2. يكشف فحص CellTiter-Glo & reg Assay عن ATP كمؤشر على وجود خلايا قابلة للحياة.

فحص جدوى بروتينات الخلية الحية

يختفي نشاط بروتياز الخلية الحية بسرعة بعد موت الخلية ، لذا فهو علامة مفيدة للخلايا القابلة للحياة. باستخدام اختبار CellTiter-Fluor ™ Cell Viability Assay (Cat. # G6080) ، يمكن قياس نشاط بروتياز الخلية الحية باستخدام ركيزة البروتياز الفلورية المنفذة للخلايا (GF-AFC). تدخل الركيزة الخلايا الحية حيث يتم شقها بواسطة بروتياز الخلية الحية لتوليد إشارة الفلورسنت المتناسبة مع عدد الخلايا القابلة للحياة (الشكل 3). وقت حضانة هذه الطريقة هو 0.5-1 ساعة ، وهو أقصر من مقايسات التيترازوليوم (1-4 ساعات). نظرًا لأن هذه الطريقة لا تعمل على تحليل الخلايا ، فهي تسمح بتعدد الإرسال مع العديد من المقايسات الأخرى في نفس آبار العينة ، بما في ذلك الاختبارات المستندة إلى الخلايا في مراسلة التلألؤ الحيوي.

الشكل 3. يكتشف فحص CellTiter-Fluor & trade نشاط البروتياز في الخلايا الحية.

فحوصات الجدوى لخلية الحد من التيرازوليوم

تنقسم مركبات التترازوليوم المستخدمة للكشف عن الخلايا القابلة للحياة إلى فئتين أساسيتين:

المركبات ذات الشحنة الموجبة (MTT) التي تخترق الخلايا القابلة للحياة بسهولة:

الخلايا القابلة للحياة مع التمثيل الغذائي النشط قادرة على تحويل MTT إلى منتج فورمازان أرجواني اللون. وبالتالي ، يمكن أن يكون تكوين اللون علامة مفيدة للخلايا القابلة للحياة. يستخدم اختبار تكاثر الخلايا غير المشعة CellTiter 96 & reg (MTT) (Cat. # G4000) هذه الكيمياء. ومع ذلك ، فإن فترة حضانة هذه الطريقة طويلة (عادة 4 ساعات). أيضًا ، منتج فورمازان غير قابل للذوبان ، لذلك يجب إضافة كاشف مذيب قبل تسجيل قراءات الامتصاص.

المركبات ذات الشحنة السالبة (MTS ، XTT ، WST-1) التي لا تخترق الخلايا:

عند استخدام فحص تكاثر الخلايا CellTiter 96 & reg AQueous One Solution (MTS) (Cat. # G3582) ، يجب دمج المركبات السالبة الشحنة مع كواشف اقتران الإلكترون الوسيطة ، والتي يمكن أن تدخل الخلايا ، ويتم تقليلها ثم الخروج من الخلية لتحويل التترازوليوم إلى منتج فورمازان القابل للذوبان. مدة حضانة هذه الطريقة 1 & ndash4 ساعات. ليست هناك حاجة لإضافة كاشف مذيب لأن الفورمازان الناتج قابل للذوبان ، مما يجعله أكثر ملاءمة.

مقايسة جدوى خلية الحد من Resazurin

ريسازورين عبارة عن صبغة مؤشر نفاذية للخلايا ذات لون أزرق غامق مع القليل من التألق الداخلي. يستخدم اختبار CellTiter-Blue & reg Cell Viability Assay (Cat. # G8080) ريسازورين لقياس صلاحية الخلية. فقط الخلايا القابلة للحياة مع التمثيل الغذائي النشط يمكن أن تقلل من ريسازورين إلى ريسوروفين ، وهو وردي وفلوريسنت. بعد 1 & ndash4 ساعات من الحضانة ، يتم قياس الإشارة باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس التألق. هذه الطريقة غير مكلفة نسبيًا وأكثر حساسية من فحوصات التيترازوليوم. ومع ذلك ، قد يتداخل التألق الناتج عن المركبات التي يتم اختبارها مع قراءات الريسوروفين.

من عيوب جميع فحوصات اختزال التترازوليوم أو الريسازورين أنها تعتمد على تراكم المنتجات الملونة أو الفلورية بمرور الوقت. نظرًا لأن الإشارة تزداد تدريجياً بمرور الوقت ، لا يمكن اكتشاف انخفاض في قابلية الخلية للحياة خلال فترة الحضانة الطويلة هذه.


عد الخلايا

يستخدم العد الآلي للخلايا طرقًا ضوئية لعد الخلايا في عينات السوائل لتطبيقات مثل توحيد التجارب وقياس تأثير الفحص. يقوم عداد الخلايا الآلي TC20 والتجارة بتقييم إجمالي عدد الخلايا وصلاحية الخلية في غضون 30 ثانية مع مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ..

  • الدقة والقابلية للتكرار مع تقنية التركيز التلقائي
  • إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة في غضون 30 ثانية
  • بوابات يحددها المستخدم للعينات المعقدة


ابدأ جولة النظام

يحتوي عداد الخلايا الآلي TC20 & trade على وضعين للعد. Depending on the sample type, the user-defined gates can be either enabled or disabled.

Samples with Multiple Cell Populations (stem cells and other primary cells)

User-defined gates must be ممكن. Once the user-defined gates are enabled, a histogram will be displayed at the beginning of each count and the user can select the population of interest by adjusting the position of the cell size gates. Only objects within the designated range will be analyzed as cells those with diameters outside of the size range will be excluded from the cell count.

If the user-defined gates are disabled, the cell counting algorithm will automatically determine the population to count without any user input. The algorithm will count the cells of the most predominate cell type that typically comprise the largest peak, which may not be the population the user wants to count.



Gating setup window. Cell size gating window.

To make counting of such samples easier, when counting multiple sample replicates, the TC20 cell counter can save the positions of gates and apply them to subsequent counts (choose نعم in the &ldquoUse saved gates&rdquo field in Gating setup).

If the Image preview is تشغيل, an image of cells will be displayed during gating. In the image, only cells with diameters between the selected size gates will be marked with a yellow dot.

Immortal Cell Lines

When counting immortal cell lines or other samples that are composed of cells with similar cell size, the user-defined gates can be معاق. The cell counting algorithm then automatically identifies the cell population of interest without requiring user input.

The data below show the TC20&trade automated cell counter is compatible with a broad range of cell types, such as cell lines, primary cells (from tissue or blood), and stem cells. The TC20 cell counter can count cells with a 6&ndash50 µm cell diameter and within a broad concentration range of 5 x 10 4 &ndash1 x 10 7 cells/ml, which eliminates the need to dilute cells, thus reducing the error associated with sample dilutions prior to counting.

The TC20 automated cell counter demonstrates accurate cell counts across a range of cell sizes. Small (PBMC, Jurkat), medium (HeLa), and large (MEF) cells were counted with a hemocytometer, a TC20 automated cell counter, and a competitor's image-based automated cell counter. The TC20 counter and hemocytometer cell counts showed no statistically significant differences. Precision is indicated by the standard deviations error bars represent average standard deviations. Cell counts on the TC20 counter were performed on one instrument with four sample replicates.

The TC20 automated cell counter demonstrates accurate counts of viable cells. Pan T cells mixed with trypan blue (1:1) were counted with a hemocytometer, a TC20 automated cell counter, and a competitor&rsquos image-based automated cell counter. The TC20 counter and hemocytometer cell counts showed no statistically significant differences. Precision is indicated by the standard deviations error bars represent average standard deviations. Cell counts on the TC20 counter were performed on four different instruments with five sample replicates.

The TC20&trade automated cell counter uses microscopy with auto-focus that analyzes multiple focal planes to identify the best plane. The cell counting algorithm then uses the image acquired from the best focal plane to identify cells and exclude debris, thereby calculating the total cell count.

Using auto-focus instead of subjective manual focusing is especially important when assessing cell viability because an incorrectly selected focal plane will lead to inaccurate results.

If trypan blue is detected along with the total cell count, the TC20 counter assesses cell viability. The conventional method of analyzing viability using a single focal plane can lead to inaccurate conclusions because light scattering and the alignment of cells at different heights in a counting chamber can change the appearance of cells &mdash live cells may appear to be dead and vice versa. To determine if cells are viable, the TC20 counter analyzes each cell using images acquired from multiple focal planes during the focusing step.


Cell Banking

VI Environmental Monitoring

The EM program is designed to ensure overall control of the production environment based on fully justified acceptance, alert, and action levels. The level of monitoring depends on site ISO class and risk of product contamination by the site’s environment (USP 〈 797 〉 ). The following EM activities must be performed in the manufacturing site.

Active air sampling and monitoring for nonviable particle count (APC). Under ISO 14644‐1, cleanliness classes are assigned to clean zones using particle size and levels detected by APC equipment. Federal Std. 209E, as applied in the pharmaceutical industry, is based on limits of all particles with size ≥0.5 μm. APC is measured using particle counters with more than one sizing channel, which provides better information about the nature of the counted particles. Both APC ≥0.5 μm and ≥5.0 μm (macroparticles) can be recorded simultaneously. The following technical activities can be considered for effective air particle monitoring:

Number of sampling locations (X): This is calculated according to ISO 14644‐1 specifications based on surface area in square meters (ص) of the tested site, where X is the square root of ص. Sampling locations are selected to be evenly distributed throughout the testing environment.

Sampling volumes: The total sampling air volume should be at least 2 liters, which can be collected over a short time (<3 min) using modern APC counters.

Sampling practice: The sampling probe should be positioned pointing into the airflow or be directed vertically upward if the direction of the airflow is not predictable. In the processing BioSafety Cabinets (BSCs), both static preprocessing sampling and dynamic in‐process sampling should be performed per production run.

Alert, action, or failure of site compliance is documented when the average calculated concentration APC is above the expected limits. Exceeding alert levels is not necessarily grounds for definitive corrective actions, but prompts a documented follow‐up investigation and possibly a transient modification of the sampling plan. A reported failure in a controlled environment requires a defined sequence of actions. Processing should not be resumed if failure involves a critical processing site such as a BSC until a resolution of the condition has been accomplished.

Active air sampling and monitoring for microbial viable particle count (AVPC): Environmental AVPC is the enumeration and identification (as needed) of microbial (bacterial/fungal) particles in air. The AVPC is determined after air flowing across the media of a culture plate is sampled using an automated microbial air sampler. Viable particle samplers are highly efficient in the collection of particles containing microbial cells in the range of 2.1–14 μm (bacterial spore size and larger). Typically, Tryptic Soy Agar (TSA) medium is used, and supports both bacterial and fungal growth if incubated at 30–35 °C for 2 to 3 days and then at 20–25 °C for 5 to 7 days. Although the medium is validated by the vendor for sterility and high growth performance, different shipments of medium should initially be verified on-site for both sterility and growth promotion activity. Frequency, sampling time, and sampling size depend on the site’s production activities and its ISO class. For sampling purposes, monitored areas are divided into equal quarters. Sampling in the BSC is taken within 1 foot downstream of the active working site. Sampling volume, time and frequency, and alert/action levels need to be decided and enacted ( Table 3 ). Corrective actions must be dictated by the identification of microorganisms recovered mainly in the BSCs. If highly pathogenic microbes and product’s common contaminants are found, an investigation of the microbial source should be performed. The investigation should ascertain whether the isolated environmental microbe was introduced into the CT product and that appropriate corrective actions were enforced.

الجدول 3 . Air Sampling for AVPC and Alert/Action Levels—Proposed Example

Manufacturing SiteNumber of Sampling QuartersInitial Frequency of MonitoringAlert Level CFU count/m 3 Action Level CFU count/m 3
BSCs, ISO-51Daily (during each processing run)1–2≥3
Processing room: ISO-74أسبوعي10–20≥20
Ante-processing room: ISO-82Bi-weekly30–60≥60
Qualification laboratory: ISO-83Monthly50–80≥80

Surface microbial sampling and monitoring for viable particle count: Sampling of hard working surfaces, equipment, and personnel is best accomplished using contact plates and/or a swabbing method. Sterile TSA medium 25-cm 2 plates are used when sampling regular surfaces and cultured to monitor bacterial and fungal growth. Samples from irregular surfaces are obtained with swabs that are placed in appropriate diluents before plating on TSA plates or by directly rolling them onto the plate. Swabbing should cover a defined area of about 25 cm 2 . The microbial colony forming unit (CFU) counts are reported per contact plate or per swab. For microbial EM, sampling is done routinely at the conclusion of processing operations. The number of samples (contact plates) used per surface is dependent on total surface area, production activities performed on the surface, and classification of the environment around the surface. For critical benches, at least 1 sample/m 2 should be taken within 1 foot of the active working site. For other benches, shelves, cabinets, sinks, doors, windows, floors, partitions, and ceiling, at least 1 sample/4 m 2 is taken in a random homogenous pattern. For BSC internal surfaces, 4 samples are taken (middle of work surface, each side, and rear panel). Table 4 shows a proposed surface microbial sampling activities and alert/action levels for production sites.

Table 4 . Frequency of Microbial Sampling a of Various Surfaces and Alert/Action Levels—Proposed Example

سطحFrequency of SamplingAlert Level of CFU Count/PlateAction Level of CFU Count/Plate
Biosafety Cabinets (ISO-5)
Internal surfaces of all BSCsDaily, if used1–3&gt3
Processing Room (ISO-7)
All benches and sinksBi-weekly5–10&gt10
Floors, ceilings, partitions, windows, doors, shelves, and cabinetsMonthly10–20&gt20
Other Sites (Controlled Unclassified ISO-8)
Critical benches and sinksMonthly20–30&gt30
Noncritical benchesQuarterly50–80&gt80
Floors, ceilings, partitions, windows, doors, shelves, and cabinetsQuarterly70–100&gt100

The development of an adequate EM program is not free of challenges. It is not clear what can be adequate, what levels can be acceptable (mainly for viable counts), and how to perform EM in various types of CT facilities. Therefore, we advise that CT facilities obtain FDA approval for the EM plan prior to implementation. The plan should consist of following:

Monitoring of all surfaces, including facility and equipment, and personnel.

Sample timing, method, frequency, and location.

Nonviable and viable (microbial) particles acceptable, alert and action levels. ( Tables 3 and 4 suggests acceptable/alert/action levels for air viable counts, and for surface viable counts in critical manufacturing sites including Class 5 cabinets.)

Results analysis for trending, investigations, and corrective actions.

Periodic review and introduction of changes related to cleaning/disinfection, and EC/EM.


شاهد الفيديو: hemocytometer عد الخلايا بشريحة هيموسيتوميتر (أغسطس 2022).