معلومة

التحكم في بروتين الصيانة / التحميل الكبير السائد (> = 90 كيلو دالتون)

التحكم في بروتين الصيانة / التحميل الكبير السائد (> = 90 كيلو دالتون)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كنت أتساءل عما إذا كان لدى أي شخص توصيات بشأن بروتينات تحكم جيدة وكبيرة (نأمل 100 كيلو دالتون +) والتي ستكون موجودة في معظم خلايا الثدييات. أنا أعمل في الغالب مع عينات الأنسجة من البشر والفئران ، وظهارة مجرى الهواء على وجه الخصوص إذا كان ذلك مهمًا. حتى الآن أفضل ما فكرت به هو HSP90 ، لكن هذا بعيد عن أن يكون مثاليًا لعدد من الأسباب. تتراوح البروتينات المستهدفة بين 125 و 210 كيلو دالتون. لتحسين الدقة ، قمنا بتشغيل كل شيء تقريبًا بأقل من 90 كيلو دالتون من الجل.

هذا يزيل الاستعدادات القديمة مثل الأكتين أو GAPDH. أفهم أن مستويات البروتين يمكن أن تختلف بين أنواع الخلايا لتحقيق هدف جيد للتحكم في التحميل. نقاط المكافأة إذا كنت تعرف استنساخًا جيدًا للأجسام المضادة.


فينكولين! أنا أحب طلابنا الخريجين ، لا أصدق أنني لم أفكر في الأمر الليلة الماضية.

أيضًا ، مخطط رائع ، حتى لو كان من شركة.


يزامن فصل طور البروتين القابل للانعكاس المنظم ROS ازدهار النبات

إن كيفية استغلال الكائنات الهوائية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) المولدة حتمًا والتي يحتمل أن تكون خطرة لفائدة الحياة الطبيعية هي مسألة بيولوجية أساسية. تم الإبلاغ عن أنواع ROS المتراكمة محليًا لتمايز الخلايا الجذعية الأولية. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية الأساسية غير واضحة. هنا ، نكشف أن H2ا2 في النبات الإنشائي القمي (SAM) يؤدي إلى فصل طور البروتين القابل للانعكاس لـ TERMINATING FLOWER (TMF) ، وهو عامل نسخ يضاعف انتقال الإزهار في الطماطم عن طريق قمع النضج المسبق لـ SAM. تستشعر بقايا السيستين داخل TMF الأكسدة الخلوية للاختزال لتشكيل روابط ثاني كبريتيد تسلسل جزيئات TMF متعددة وترفع كمية المناطق المضطربة جوهريًا لدفع فصل الطور. يُمكِّن فصل الطور الناتج عن الأكسدة TMF من ربط وعزل محفز جين الهوية الزهرية أنانثا لقمع تعبيرها. يمنح التكثيف النسخي القابل للانعكاس عبر فصل الطور المنظم للاختزال الكائنات الهوائية مرونة في التحكم في الجينات في التعامل مع الإشارات التنموية.


الملخص

حدد نهج الفحص الجيني الأمامي orf19.2500 كجينات تتحكم في الجينات المبيضات البيض تشتت الأغشية الحيوية وانفصال الأغشية الحيوية. كشفت نمذجة البروتينات ثلاثية الأبعاد والمعلوماتية الحيوية أن orf19.2500 عبارة عن بروتين ميتوكوندريا محفوظ ، مشابه هيكليًا لعائلة التركيبات السكوالين / الفيتوين ، ولكنه تباعد وظيفيًا عنها. ال ج. البيض يتميز orf19.2500 بثلاث امتدادات مكتسبة تطوريًا من إدراج الأحماض الأمينية ، غائبة عن جميع حقيقيات النوى الأخرى باستثناء عدد صغير من الفطريات غير الكاملة. أظهرت الاختبارات الكيميائية الحيوية أن orf19.2500 مطلوب لتجميع ونشاط مركب NA D H u biquinone oxidoreductase I (CI) لسلسلة نقل الإلكترون في الجهاز التنفسي (ETC) وبالتالي تمت تسميته NDU1. NDU1 ضروري للتنفس والنمو في مصادر الكربون البديلة ، وهو مهم للتهرب المناعي ، وهو ضروري للفوعة في نموذج الفأر لداء المبيضات المنتشر بشكل دموي ، ولتعزيز المقاومة للأدوية المضادة للفطريات. دراستنا هي أول تقرير عن البروتين الذي يحدد ال الكانديدا-مثل الفطريات نسبيًا بصرف النظر عن جميع حقيقيات النوى الأخرى ، استنادًا فقط إلى "اكتساب" تطوري لإدخالات الأحماض الأمينية الجديدة التي تعد أيضًا المحور الوظيفي للبروتين.

الاقتباس: Mamouei Z و Singh S و Lemire B و Gu Y و Alqarihi A و Nabeela S وآخرون. (2021) يتحكم بروتين الميتوكوندريا المتشعب تطوريًا في نمو الأغشية الحيوية والفوعة في المبيضات البيض. بلوس بيول 19 (3): e3000957. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000957

محرر أكاديمي: أنيتا سيل ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، الولايات المتحدة

تم الاستلام: 11 سبتمبر 2020 وافقت: 29 يناير 2021 نشرت: 15 مارس 2021

حقوق النشر: © 2021 Mamouei et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

توافر البيانات: يمكن العثور على البيانات داخل المخطوطة.

التمويل: تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AI141794-01A1 الممنوحة إلى PU ، 1R01AI141202-01 الممنوحة لمنظمة العفو الدولية. لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الاختصارات: 3D ، ثلاثي الأبعاد BN-PAGE ، أزرق أصلي PAGE BSA ، زلال مصل بقري CFU ، وحدة تشكيل مستعمرة CI ، مجمع I CII ، مجمع II DOX ، دوكسيسيكلين ETC ، سلسلة نقل الإلكترون FDA ، فلوريسئين ثنائي الأسيتات FGSC ، مركز مخزون الوراثة الفطرية FPS ، farnesyl thiopyrophosphate HUVEC ، الخلايا البطانية للحبل السري البشري LDH ، نازع هيدروجين اللاكتات mNDU1 ، NDU1 MOPS الناضج ، morpholinepropanesulfonic acid OCR ، معدل استهلاك الأكسجين OPK ، قتل opsonophagocytic OPM ، توجهات البروتينات في الأغشية PHYS ، phytms الأكسجين الأنواع SE ، المطاط الصناعي SQS ، سكوالين سينثيز TCA ، حمض الكربوكسيليك WT ، من النوع البري


النتائج

يتفاعل Sec1 مع الوحدة الفرعية exocyst Sec6

للفحص المباشر للتفاعلات بين الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية و Sec1 ، قمنا بتنقية Sec1-V5-His6 (يُطلق عليها فيما بعد Sec1) من الخميرة وتثبيتها باستخدام جسم مضاد α-V5 على راتنج البروتين G (كما في Togneri وآخرون.، 2006). تم اختبار الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية المؤتلفة المنقى بشكل فردي لقدرتها على ربط Sec1. من الوحدات الفرعية الثمانية للكيسة الخارجية ، Sec6 (Sivaram وآخرون.، 2005)، Sec8 (Sivaram وآخرون.، 2006)، Sec10 (الأحماض الأمينية 145-827 Croteau وآخرون.، 2009) ، Exo70 (63-623 دونغ وآخرون.، 2005) ، والمنطقة الطرفية C من Exo84 (523-753 Dong وآخرون.، 2005) كانت قابلة للذوبان ولم يتم اختبار الوحدات الفرعية الأخرى. كانت Purified Sec6 هي الوحدة الفرعية الوحيدة التي تتفاعل بقوة وبشكل خاص مع Sec1 (الشكل 1 ، A-C). ثابت التفكك الظاهر (كد) بين Sec1 و Sec6 ، بناءً على الفحص المنسدل ، كان 1.7 ± 0.4 ميكرومتر (الشكل 1 د). هذا التقارب أضعف قليلاً من الظاهر كد للتفاعل Sec6 – Sec9 ، ∼0.5 ميكرومتر (Sivaram وآخرون.، 2005) ، وللتفاعل المركب Sec1 – SNARE ، 0.3 ميكرومتر (Togneri وآخرون.، 2006). تم تجميد تفاعل الربط Sec6 - Sec1 المتبادل Sec6 باستخدام علامة تقارب Strep الطرفية C المرتبطة بـ Sec1 المنقى (الشكل 1E). أشار التعيين السابق إلى أن المجال N-terminal الخاص بـ Sec6 مطلوب من أجل dimerization ولربط كل من Sec9 والوحدة الفرعية exocyst Sec8 (Sivaram وآخرون.، 2005 ، 2006). على العكس من ذلك ، فإن المجال الطرفي Sec6 C (411-805) كافٍ لربط الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية Sec10 و Exo70 (Sivaram وآخرون.، 2006). نوضح هنا أن المجال الطرفي Sec6 C ليس كافيًا لربط Sec1 (الشكل 1B) ، مما يشير إلى أن المجال N-terminal الخاص بـ Sec6 ضروري أيضًا لمجمع Sec6 – Sec1. لقد حالت عدم قابلية انحلال مجال Sec6 N-terminal في عزلة حتى الآن دون إجراء اختبار مباشر لهذه المنطقة.

الشكل 1: يتفاعل Sec1 مع الوحدة الفرعية exocyst Sec6. (أ) تنقيته Sec1-V5-His6 تم تجميده باستخدام الجسم المضاد α-V5 وخلطه مع الوحدات الفرعية للكيس الخارجي المنقى: Sec6 و Exo70 (63-623) و Sec10 (145-827). تم تشغيل العينات المدخلة والمحددة على هلام SDS-PAGE بنسبة 8 ٪ وتم تلوينها بصبغة كوماسي الزرقاء. (ب) تم إجراء تجارب مماثلة باستخدام المجال الطرفي C (411-805) من Sec6 و Exo84 (523-753). تم تشغيل العينات المدخلة والمربوطة على هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪ وملطخة بصبغة كوماسي الزرقاء. فقط Sec6 كامل الطول منضم إلى Sec1. (C) Sec1-V5-His6 تم تجميده واحتضانه باستخدام Ni NTA- تم تنقيته له6-الثانية. في هذه الحالة ، المدخلات والبروتينات المرتبطة (وكلها له6 tagged) بواسطة النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد α-His5. (د) منحنى الربط التمثيلي لـ Sec6 – Sec1. تم تجميد Sec1 على الخرز واحتضانه بتركيزات متزايدة من Sec6. كان ثابت الربط الظاهر 1.7 ± 0.4 ميكرومتر (يعني ± SEM) من النوبات إلى ثلاث تجارب مختلفة. (هـ) تفاعل الربط Sec6 – Sec1 متبادل. تم تجميد Sec6 المنقى بعلامات Strep على راتينج Strep-Tactin وحضنت باستخدام Sec1 المنقى. تم تشغيل العينات المدخلة والمحددة على هلام SDS-PAGE بنسبة 8 ٪ وتم تلوينها بصبغة كوماسي الزرقاء. لجميع التجارب ، يشير Hc و Lc إلى السلاسل الثقيلة والخفيفة للجسم المضاد α-V5 ، على التوالي. لتجنب تسرب البروتينات بين الممرات المختلفة ، غالبًا ما يتم تشغيل المواد الهلامية باستخدام ممرات فارغة بين المدخلات والممرات الفارغة المرتبطة من نفس الجل والتي تم تحريرها باستخدام Photoshop. لجميع التجارب ، يتم عرض المواد الهلامية التمثيلية لثلاث مرات على الأقل.

كعنصر تحكم إيجابي ، تم تحليل Sec1 المنقى لضمان الارتباط المحدد لـ Sec1 بمجمعات SNARE الثلاثية التي تحتوي على Sec9 ، وشريكها t-SNARE Sso1 (بناء الخميرة الخارجة للخلايا) ، و v-SNARE Snc2 (Togneri وآخرون.، 2006 الشكل 2 أ). وجدنا أيضًا أن كلاً من Sec9 و Sso1 يمكنهما الارتباط بشكل ضعيف بـ Sec1 بتركيزات عالية (≥10 و 20 ميكرومتر ، على التوالي الشكل 2 و B و C). لم يتم ملاحظة هذه التفاعلات من قبل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى انخفاض تركيزات البروتين المستخدمة في تلك التجارب (≤10 ميكرومتر سكوت. وآخرون.، 2004 توجنيري وآخرون.، 2006). ومع ذلك ، فإن هذه التفاعلات ليست غير متوقعة تمامًا ، لأنه قد لوحظ ارتباط nonsyntaxin SNAREs لبروتينات SM الأخرى (Peng and Gallwitz ، 2004 Carpp وآخرون.، 2006 شو وآخرون., 2010).

الشكل 2: التفاعلات بين الثانية والثالثة. (أ) تم تحضين مجمعات SNARE الثنائية والثلاثية المنقى مع Sec1-V5-His6. تم تشغيل العينات المدخلة والمربوطة على هلام SDS-PAGE بنسبة 15٪ وملطخة بصبغة كوماسي الزرقاء. (ب ، ج). معايرة لتركيزات متزايدة من Sso1 أو Sec9 لتثبيتها Sec1-V5-His6. تم تشغيل العينات المربوطة على 12٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE وصبغتها بصبغة كوماسي الزرقاء. لوحظ بعض روابط الخلفية من Sec9 إلى Sec1 بتركيزات عالية من Sec9 (30 ميكرومتر).

أكدت تحليلات الترشيح التحليلية للهلام التفاعل Sec6 – Sec1 في الحل (الشكل 3). يهاجر Sec1 كمونومر ، في حين يعمل Sec6 في الغالب على شكل ثنائى ، مع كتف في ذروة ترشيح الهلام المتوافقة مع كمية صغيرة من مونومري Sec6 (بما في ذلك علامات التقارب ، Sec1 هو 89 كيلو دالتون و Sec6 هو 95 كيلو دالتون). تم الإبلاغ سابقًا عن Dimerization of Sec6 (Sivaram وآخرون.، 2005) ، ومع ذلك ، لم يتم إثبات وجود مونومر Sec6 لأن طريقة الكشف المستخدمة للتحليلات كانت أقل حساسية (المواد الهلامية الملطخة Coomassie مقابل البقع الغربية التي تم تحليلها باستخدام جسم مضاد محدد α-Sec6). يهاجر مجمع Sec6 – Sec1 ، كما يستدل من زيادة الوزن الجزيئي الظاهر لـ Sec1 ، بوزن جزيئي ظاهر مماثل لوزن Sec6 dimer (الوزن الجزيئي الظاهري ∼180 kDa) ، مما يشير إلى أن مجمع Sec6 Sec1 يحتوي على 1: 1 قياس العناصر المتكافئة ، مع ربط Sec1 بالشكل الأحادي لـ Sec6. هذا على عكس القياس المتكافئ 2: 2 لمجمع Sec6-Sec9 (الشكل 3 Sivaram وآخرون.، 2005) ولكنها متوافقة مع قياس العناصر المتفاعلة التي تم تحديدها لمجمع الكيسة الخارجية المجمعة لوحدة فرعية واحدة لكل مجمع (TerBush وآخرون., 1996).

الشكل 3: Sec9 يتنافس مع Sec1 لربط Sec6. تم تشغيل ترشيح الهلام التحليلي (عمود Superdex 200) من Sec1 و Sec6 و Sec9CT المنقى ، وتم رصد التوليفات المختلفة بواسطة الامتصاص عند 280 نانومتر. يتم عرض أحجام الاحتفاظ بمعايير γ-globulin (158 كيلو دالتون) والألبومين البيضاوي (44 كيلو دالتون) للمقارنة. تم تحديد وجود كل بروتين في الكسور بواسطة تحليلات اللطخة الغربية باستخدام α-V5 للأجسام المضادة Sec1 و α-Sec6 و α-Sec9. لاحظ أن معامل الانقراض المولي Sec9 عند 280 نانومتر أقل بمقدار 30 ضعفًا من معامل Sec6 و Sec1.

ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة كميات متساوية من Sec1 و Sec6 و Sec9 معًا نتج عنها مجمع Sec6 - Sec9 (الوزن الجزيئي الظاهر ، ∼235 كيلو دالتون) ومونومري Sec1 (الوزن الجزيئي الظاهري ، ∼90 كيلو دالتون). لم يتم ملاحظة مجمعات Ternary Sec6-Sec9-Sec1. وبالتالي ، يتنافس Sec9 بقوة مع Sec1 لربط Sec6 ، مما يشير إلى أن مواقع الربط Sec1 و Sec6 في Sec6 متشابهة أو أن ربط Sec1 يؤدي إلى تغيير تكويني في المطابقة في Sec6 غير متوافق مع ربط Sec9. علاوة على ذلك ، يبدو أن ارتباط Sec1 يتنافس مع Sec6 dimerization ، في حين أن جزيئين من Sec9 يرتبطان لكل Sec6 dimer. يتم دعم هذه البيانات من خلال نتائجنا التي توضح أن المجال N-terminal الخاص بـ Sec6 مطلوب لربط كل من Sec1 و Sec9 وأيضًا من أجل dimerization (الشكل 1B Sivaram وآخرون.، 2005). ومع ذلك ، نظرًا لأن Sec1 يتنافس مع Sec6 dimerization بينما Sec9 لا ، فإن مواقع الربط لـ Sec1 و Sec9 في Sec6 ليست متطابقة ولكن من المحتمل أن تتداخل.

يتفاعل Sec6 – exocyst مع Sec1 ، بينما يرتبط Sec6 غير المرتبط بالكيس الخارجي بـ Sec9

لاختبار تفاعلات Sec6 في الجسم الحي ، تم استخدام الجسم المضاد α-HA للترسيب المناعي Sec6-HA3 من محلولات الخميرة. جزء صغير من Sec9 coimmunoprecipitated مع Sec6 ، ما لم يتم الإفراط في التعبير عن Sec9 (الشكل 4A). أنتج الارتباط غير المحدد لـ Sec1 بالجسم المضاد α-HA مستويات خلفية عالية ، لذلك ، عبرنا عن Sec1-V5 في Sec6-HA3 سلالة والمناعة Sec1 مع الجسم المضاد α-V5. Sec6 coimmunoprecipitated مع Sec1-V5 (الشكل 4B) كانت كمية Sec6 coimmunoprecipitated أعلى باستمرار من مستويات الخلفية ، على الرغم من أن المبلغ المرتبط كان جزءًا فقط (∼1 ٪) من إجمالي Sec6 في الخلية. كانت هذه النسبة المنخفضة مماثلة للمبلغ الذي لاحظناه للتفاعل بين Sec6 و Sec9 (الشكل 4 أ). على النقيض من ذلك ، فإن الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية الأخرى تتعاون بسهولة مع الراسب المناعي مع Sec6-HA3 (سونجر ومونسون ، 2009). تتوافق بيانات Sec1 - Sec6 مع النتائج السابقة من مختبر Novick ، ​​حيث يتم ربط كمية قابلة للمقارنة (∼0.2–0.4٪) من Sec1 بمركب exocyst ، عندما يتم تفريغ المناعة باستخدام Sec8-Myc أو Sec10-Myc (Wiederkehr وآخرون.، 2004). اقترحت هذه النتائج معًا أن Sec1 يمكن أن يتفاعل مع Sec6 المرتبط بالكيس الخارجي.

الشكل 4: يتفاعل Sec6 مع Sec9 و Sec1 في الجسم الحي. (أ) الترسيب المناعي لـ Sec6-HA3 من محلول الخميرة مع الجسم المضاد α-HA يسحب بروتين Sec9 و Sec9 الداخلي الكامل الطول المفرط من بلازميد 2μ. تم تشغيل المدخلات والعينات المرتبطة على 8٪ SDS – PAGE وتم تكديسها مناعيًا لـ Sec6 و Sec9. (ب) Sec1 المناعي من روابط محللة الخميرة المعبر عنها داخليًا Sec6-HA3. تم تشغيل عينات المدخلات والعينات المرتبطة على 8٪ SDS – PAGE وتقسيم مناعي لعلامات حلقية V5 و HA.

اختبرنا ما إذا كان Sec6 المؤتلف يمكن أن يتفاعل مع Sec1 أثناء ربطه بوحدات فرعية خارجية أخرى في المختبر. يبدو أن الارتباطات الزوجية لتفاعلات الكيس الخارجي مع الكيس الخارجي ضعيفة جدًا (تقدر بـ 10 ميكرومتر دونغ وآخرون.، 2005 سيفارام وآخرون.، 2006). لذلك قمنا بتحليل ارتباط Sec6 – Sec1 بمجموعة من الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية. تم تجميد Sec1 على الراتنج وتثبيته مسبقًا إلى Sec6. بعد الغسيل لإزالة Sec6 غير المنضم ، تمت إضافة خليط متساوي الأقطاب من Exo70 و Sec10 و Exo84CT. كانت الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية قادرة على التفاعل بشكل ضعيف مع مجمع Sec6 – Sec1 (الشكل 5A). أظهر Exo70 أقوى تفاعل ، بينما أظهر Sec10 و Exo84CT أيضًا بعض الارتباط غير المحدد بالراتنج. في المقابل ، لم يتفاعل Sec6 المرتبط بـ MBP-Sec9CT المعطّل مع الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية (الشكل 5 ب). تشير هذه البيانات معًا إلى أن Sec1 يمكن أن يتفاعل مع Sec6 في وجود الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية الأخرى وقد يشكل معقدًا ضعيفًا أو عابرًا مع الكيس الخارجي في الجسم الحي. في المقابل ، يبدو أن Sec9 يتنافس مع الوحدات الفرعية للكيسة الخارجية لربط Sec6.

الشكل 5: يتفاعل Sec1 مع Sec6 المرتبط بالكيس الخارجي ، بينما يتفاعل Sec9 مع Sec6 غير المرتبط بالكيس الخارجي. (أ) في المختبر ، تمت إضافة الوحدات الفرعية للكيسات الخارجية المنقى في وقت واحد بتركيز 1.5 و 5 ميكرومتر إلى مثبت مسبقًا Sec1-V5-His6مجمعات -Sec6. بعد ساعة واحدة من الحضانة عند 4 درجات مئوية ، تم تشغيل عينات المدخلات والمربوطة على 8 و 12 ٪ SDS-PAGE وصبغتها بصبغة Coomassie الزرقاء. (ب) تم إجراء تجارب مماثلة باستخدام MBP-Sec9 معطلة على راتنج الأميلوز. تم تحضين الوحدات الفرعية للكيسات الخارجية المنقى (5 ميكرومتر) مع مجمعات Sec9 أو مجمعات Sec9 - Sec6 التي تم تجميدها مسبقًا. تم تشغيل البروتينات المقيدة على المواد الهلامية SDS – PAGE وصبغتها بصبغة كوماسي الزرقاء. تشير علامة النجمة إلى منتج تدهور لبروتين MBP-Sec9. (ج) تم تحليل الترشيح التحليلي للهلام Superose 6 10/30 لمحلول الخميرة بواسطة تحليلات اللطخة الغربية باستخدام أجسام مضادة متعددة النواقل. تم تطبيع شدة النطاق إلى النطاق الأكثر كثافة كما تصوره ECL ، وتم حساب متوسط ​​نقاط البيانات على مدى ثلاثة أشواط ، وتمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± SEM.

كما دعمت دراسات الترشيح الهلامي هذه الفكرة. تم تشغيل Sec1 و Sec9 والوحدات الفرعية exocyst من محللات الخميرة على عمود ترشيح جل تحليلي ومراقبة تنقلهم بواسطة تحليلات لطخة غربية (الشكل 5C). لقد أظهرنا سابقًا أن Sec6 موجود في كل من الكسور المرتبطة بالكيس الخارجي وغير المرتبط بالكيس الخارجي ، على الرغم من تباين أحجام المجمعات اختلافًا كبيرًا بين التجارب المختلفة (Sivaram وآخرون.، 2005). لقد اقترحنا في الأصل أن المجموعة غير المتكيسة تحتوي على ثنائى من Sec6 لأنها هاجرت بحوالي ضعف الوزن الجزيئي لـ Sec6 ، لكننا لم نتمكن من استبعاد المجمعات الأخرى التي تحتوي على Sec6. وجدنا هنا أن مجمعات الأكياس الخارجية المجمعة هاجرت في شكل ذروة واضحة (∼10-12.5 مل) ، بوزن جزيئي ظاهر يبلغ & gt1 MDa. لوحظ وجود تجمع غير متكيس من Sec6 (93 كيلو دالتون) (وزن جزيئي ظاهر ∼250 كيلو دالتون) ، والذي تم تجميعه بجزء صغير من Sec8 (122 كيلو دالتون). لوحظ أيضًا تجمع غير مرتبط بالكيس الخارجي من Exo70 (الوزن الجزيئي الظاهر ∼70 كيلو دالتون) ، بما يتوافق مع تجمع أحادي من Exo70 (الوزن الجزيئي 71 كيلو دالتون) الموجود في غشاء البلازما (بويد وآخرون.، 2004 هو وآخرون.، 2007). تم العثور على الذروة الرئيسية لـ Sec1 كأنواع ذات وزن جزيئي مرتفع (الوزن الجزيئي الظاهري & gt1 MDa) ، والتي تتداخل جزئيًا مع ذروة مجمع exocyst. تتوافق حركة Sec1 مع جزء صغير من Sec1 يتفاعل مع الكيس الخارجي (Wiederkehr وآخرون.، 2004) ، مع تفاعل الغالبية إما مع شركاء ملزمون آخرين أو قلة القلة. على العكس من ذلك ، تم العثور على Sec9 في الغالب كأنواع ذات وزن جزيئي منخفض ، مع تداخل التنقل مع تجمع Sec6 غير المرتبط بالكيس الخارجي. الوزن الجزيئي الظاهر (600 كيلو دالتون) لـ Sec9 هو أيضًا أكبر بكثير من المتوقع للمونومر (74 كيلو دالتون) ، مما يشير إلى قلة القلة و / أو التفاعلات مع الشركاء الآخرين. بالإضافة إلى ذلك ، كان العديد من البروتينات موجودًا في حجم الفراغ (8 مل) من العمود ، مما يشير إلى أنها كانت تشكل أوليغومرات أو تجمعات كبيرة. تدعم دراسات ترشيح الهلام فكرة أن تفاعل Sec6 - Sec1 يحدث داخل مجمع exocyst ، ولكن يتم استبعاد Sec6 - Sec9 من مجمع exocyst.

تنظيم التجمع الثنائي SNARE المعقدة

خطوة تحديد المعدل في التجميع المركب SNARE هي ربط Sec9 بالبنية syntaxin Sso1 (أو نظيره Sso2 Nicholson وآخرون.، 1998). يتم منع تكوين مركب Sec9 – Sso1 في المختبر وفي الجسم الحي بواسطة مجال التثبيط الذاتي للطرف N لـ Sso1 (Nicholson وآخرون.، 1998 مونسون وآخرون.، 2000 Munson and Hughson ، 2002). يجب تحرير هذا المنع التلقائي Sso1 على وجه التحديد عند وصول الحويصلة إلى مواقع الإفراز لتسهيل تجميع مركب t-SNARE. بعد ذلك ، يرتبط v-SNARE Snc2 (أو نظيره Snc1) ، مما يؤدي إلى اندماج الغشاء (Nicholson وآخرون.، 1998). العوامل التي تطلق تثبيط Sso1 غير معروفة.

افترضنا في الأصل أن الوحدة الفرعية للكيس الخارجي Sec6 ، لأنها تربط Sec9 ، قد تكون العامل الذي يطلق تثبيط Sso1 ، مما يفتحه لتجميع مركب SNARE. بدلاً من ذلك ، فإن إضافة Sec6 المنقى تمنع تكوين مركب Sso1 – Sec9 SNARE الثنائي بمقدار 3.5 أضعاف (Sivaram وآخرون.، 2005 الشكل 6 أ). التفسير المحتمل هو أن Sso1 لديه معدل غير متكرر للفتح التلقائي عندما يصبح Sso1 مفتوحًا ، Sec9 غير متاح لأنه مرتبط بـ Sec6 ، مما يقلل من التركيز الفعال لـ Sec9 المجاني ويبطئ معدل تجميع SNARE. يتم دعم تثبيط Sec6 لتجميع مركب SNARE من خلال التجارب الوراثية للخميرة. يُظهر الإفراط في التعبير عن Sec6 ، وهو ليس سامًا لخلايا الخميرة من النوع البري ، تأثيرًا اصطناعيًا قويًا عند دمجه مع ثانية 9-4 طفرة حساسة لدرجة الحرارة ، تمنع نمو الخلايا (الشكل 6 ب). على النقيض من ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن أي من الوحدة الفرعية للكيس الخارجي Sec5 أو Sec1 ، والذي يُقترح أن يكون له دور إيجابي في التجميع المركب لـ SNARE ودمج الغشاء ، ليس له أي تأثير على نمو ثانية 9-4 الخلايا.

الشكل 6: تثبيط Sec6 لتجميع مركب SNARE. (أ) يمنع Sec6 تشكيل Sec9 – Sso1 ولا يتم تخفيف ذلك بإضافة Sec1. تم تحضين بروتينات Sec6 ± Sec1 المنقى بتركيزات متساوية مع Sso1 و Sec9 لمدة 0 أو 8 ساعات عند 18 درجة مئوية للسماح بتجميع مركب SNARE. تم إجراء التفاعلات على مواد هلامية PAGE أصلية بنسبة 6٪ وملطخة باللون الأزرق كوماسي. تم عرض المواد الهلامية التمثيلية (تم تشغيل أكثر من ثلاث تجارب في أربع نقاط زمنية مختلفة) للنقاط الزمنية 0 ساعة (وسط) و 8 ساعات (يمين) ، تم تشغيل البروتينات غير المعقدة على هلام منفصل للمقارنة (يسار). تشير علامة النجمة إلى إمكانية تنقل مجمع Sso1 – Sec9. (ب) الإفراط في التعبير عن SEC6، لكن لا SEC5 أو SEC1، لديه عيب اصطناعي عند دمجه مع ثانية 9-4. سلسلة تخفيف عشرة أضعاف من النوع البري أو ثانية 9-4 سلالات ، تحولت مع المتجه وحده ، Gal-SEC6، فتاه-SEC5، أو غال-SEC1-V5- صاحب6، على ألواح SC-leu أو SC-ura ، على التوالي ، تحتوي إما على الجلوكوز أو الجالاكتوز ، وتم تحضينها في درجات الحرارة المحددة.

إمكانية واحدة لمتطلبات Sec1 قبل تجميع مجمع SNARE (Hashizume وآخرون.، 2009) هو أن Sec1 من شأنه أن يربط Sec6 من أجل تحرير وسيط Sec6 – Sec9 المانع ، لدفع التجميع المركب الثنائي SNARE. ومع ذلك ، تمشيا مع عدم قدرة Sec1 على التنافس بقوة مع Sec9 لربط Sec6 (الشكل 3) ، وجدنا أن إضافة Sec1 إلى التفاعل المحتوي على Sec6 لم يزيد من معدل تجميع SNARE (الشكل 6 أ). في الواقع ، أدت إضافة Sec1 وحده إلى تثبيط التفاعل قليلاً ، وإن لم يكن بنفس القدر مثل Sec6 ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى التفاعلات الضعيفة المنافسة Sec1 - Sec9 و Sec1 - Sso1 (الشكل 2 و B و C). على النقيض من ذلك ، فإن الوحدة الفرعية Exo84CT ، التي لا تتفاعل مباشرة مع Sec6 في حالة عدم وجود وحدات فرعية خارجية أخرى ، ليس لها أي تأثير على معدل تجميع مركب SNARE الثنائي. وبالتالي ، فإن تفاعل Sec1 - Sec6 وحده لا يكفي لتعزيز تفاعل التجميع المركب SNARE في المختبر.


مراجع

صديق ، إس إتش وآخرون. جزء من الحمض النووي البشري له خصائص الجين التي تهيئ للورم الأرومي الشبكي والساركوما العظمية. طبيعة سجية 323, 643–646 (1986).

Classon، M. & amp Harlow، E. مثبط الورم الأرومي الشبكي في التطور والسرطان. القس الطبيعة. السرطان 2, 910–917 (2002).

Sherr، C.J & amp McCormick، F. مسارات RB و p53 في السرطان. الخلايا السرطانية 2, 103–112 (2002).

van den Heuvel، S. & amp Dyson، N.J. وظائف محفوظة لعائلات pRB و E2F. القس الطبيعة مول. خلية بيول. 9, 713–724 (2008).

Burkhart، D.L & amp Sage، J. الآليات الخلوية لقمع الورم بواسطة جين الورم الأرومي الشبكي. القس الطبيعة. السرطان 8, 671–682 (2008).

مانينغ ، إيه إل آند دايسون ، إن جيه آر بي: الآثار الانقسامية لقمع الورم. القس الطبيعة. السرطان 12, 20–226 (2012).

MacPherson، D. & amp Dyer، M. A. الورم الأرومي الشبكي: من فرضية الضربتين إلى العلاج الكيميائي المستهدف. الدقة السرطان. 67, 7547–7550 (2007).

Knudsen ، E. S. & amp Knudsen ، K.E. التكييف وفقًا لـ RB: حالة مثبط الورم والاستجابة العلاجية. القس الطبيعة. السرطان 8, 714–724 (2008).

Dyson، N. تنظيم E2F بواسطة بروتينات عائلة pRB. تطوير الجينات. 12, 2245–2262 (1998).

Lee ، J.-O. ، Russo ، A.A & amp Pavletich ، N. P. هيكل مجال الجيب الكابت للورم الشبكي المرتبط بببتيد من فيروس الورم الحليمي البشري E7. طبيعة سجية 391, 859–865 (1998).

هاسلر ، إم وآخرون. يوفر التركيب البلوري لمجال بروتين الورم الأرومي الشبكي N نظرة ثاقبة لقمع الورم وتفاعل الترابط وبنية البروتينات الشاملة. مول. زنزانة 28, 371–385 (2007).

Rubin، S. M.، Gall، A.L، Zheng، N. & amp Pavletich، N.P. هيكل المجال الطرفي Rb C المرتبط بـ E2F1 – DP1: آلية لإطلاق E2F الناجم عن الفسفرة. زنزانة 123, 1093–1106 (2005).

Burke ، J.R ، Deshong ، A. J. ، Pelton ، J.G & amp Rubin ، S.M. J. بيول. تشيم. 285, 16286–16293 (2010).

Burke ، J.R ، Hura ، G.L & amp Rubin ، S. M. تكشف هياكل بروتين الورم الأرومي الشبكي غير النشط عن آليات متعددة للتحكم في دورة الخلية. تطوير الجينات. 26, 1156–1166 (2012). يفحص الاتصالات الجزيئية للفوسفات على RB وكيف تؤثر على بنية مجال الجيب.

Lee ، C. ، Chang ، J.H ، Lee ، H. S. & amp Cho ، Y. الأساس الهيكلي للاعتراف بمجال معاملات E2F بواسطة مثبط الورم الأرومي الشبكي. تطوير الجينات. 16, 3199–3212 (2002).

شياو ، ب. وآخرون. التركيب البلوري للبروتين المثبط للورم في الشبكية المرتبط بـ E2F والأساس الجزيئي لتنظيمه. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 2363–2368 (2003).

كيم ، H.-Y. ، Ahn ، B.-Y. & amp Cho، Y. الأساس الهيكلي لتعطيل مثبط الورم الأرومي الشبكي بواسطة مستضد SV40 T الكبير. EMBO J. 20, 295–304 (2001).

Lee ، J. O. ، Russo ، A. A. & amp Pavletich ، N. P. هيكل مجال الجيب الورم الأرومي الشبكي المرتبط بببتيد من فيروس الورم الحليمي البشري E7. طبيعة سجية 391, 859–865 (1998).

Brehm، A. & amp Kouzarides، T. يلتقي بروتين الورم الأرومي الشبكي بالكروماتين. اتجاهات Biochem. علوم. 24, 142–145 (1999).

موريس ، إي جيه وأمبير دايسون ، إن جيه شركاء بروتين الورم الأرومي الشبكي. حال. الدقة السرطان. 82, 1–54 (2001).

Singh، M.، Krajewski، M.، Mikolajka، A. & amp Holak، T. A. المحددات الجزيئية للتكوين المعقد بين بروتين الورم الأرومي الشبكي وتسلسل LXCXE. J. بيول. تشيم. 280, 37868–37876 (2005).

بين ، يو ك وآخرون. يتفاعل بروتين الورم الأرومي الشبكي والمجمع المعزز للطور جسديًا ويتعاونان وظيفيًا أثناء الخروج من دورة الخلية. خلية الطبيعة بيول. 9, 225–232 (2007).

Longworth، M. S.، Herr، A.، Ji، J. Y. & amp Dyson، N.J.RBF1 يعزز تكثيف الكروماتين من خلال تفاعل محفوظ مع بروتين dCAP-D3 المكثف. تطوير الجينات. 22, 1011–1024 (2008).

فيرا ، د. وآخرون. تحديد وتوصيف مضادات الجزيئات الصغيرة لتثبيط pRb بواسطة البروتينات الورمية الفيروسية. تشيم. بيول. 19, 518–528 (2012).

Dick، F.A & amp Dyson، N. pRB يحتوي على مجال ربط خاص بـ E2F1 يسمح بتنظيم موت الخلايا المبرمج الناجم عن E2F1 بشكل منفصل عن أنشطة E2F الأخرى. مول. زنزانة 12, 639–649 (2003).

Julian، L.M، Palander، O.، Seifried، L.A، Foster، J.E & amp Dick، F. الأورام 27, 1572–1579 (2008).

آدامز ، بي دي وآخرون. يحتوي بروتين الورم الأرومي الشبكي على نموذج C- طرفي يستهدفه من أجل الفسفرة بواسطة مجمعات cyclin-CDK. مول. زنزانة. بيول. 19, 1068–1080 (1999).

هيرشي ، إيه وآخرون. ينظم موقع الالتحام المتداخل للكيناز والفوسفاتيز نشاط بروتين الورم الأرومي الشبكي. هيكل الطبيعة. مول. بيول. 17, 1051–1057 (2010). يوضح أن CDKs و phosphatases تتنافس للوصول إلى موقع ربط مشترك على RB لتنظيم حالة الفسفرة.

Pan ، W. ، Cox ، S. ، Hoess ، R. H. & amp Grafstrom ، R.H. موقع ربط kinase 4 المعتمد على cyclin D1 / cyclin ضمن المجال C لبروتين الورم الأرومي الشبكي. الدقة السرطان. 61, 2885–2891 (2001).

Weinberg ، R.A بروتين الورم الأرومي الشبكي والتحكم في دورة الخلية. زنزانة 81, 323–330 (1995).

Hiebert، S. W.، Chellappan، S. P.، Horowitz، J.M & amp Nevins، J.R .. يتزامن تفاعل RB مع E2F مع تثبيط نشاط النسخ لـ E2F. تطوير الجينات. 6, 177–185 (1992).

Qin، X.Q.، Chittenden، T.، Livingston، D.M & amp Kaelin، W.G Jr. تحديد مجال قمع النمو داخل المنتج الجيني للورم الأرومي الشبكي. تطوير الجينات. 6, 953–964 (1992).

روبن ، إس م.فك رموز كود فسفرة بروتين الورم الأرومي الشبكي. اتجاهات Biochem. علوم. 38, 12–19 (2013).

براون ، في دي ، فيليبس ، آر إيه وأمبير جالي ، بي إل التأثير التراكمي لفسفرة pRB على تنظيم نشاط E2F. مول. زنزانة. بيول. 19, 3246–3256 (1999).

Knudsen ، E. S. & amp Wang ، J. Y. آليات مزدوجة لتثبيط ارتباط E2F بـ RB عن طريق الفسفرة RB المعتمدة على السيكلين. مول. زنزانة. بيول. 17, 5771–5783 (1997).

Kolupaeva، V. & amp Janssens، V. PP1 and PP2A phosphatases - شركاء متعاونون في تعديل تنشيط بروتين الورم الأرومي الشبكي. FEBS J. 280, 627–643 (2012).

Munro، S.، Carr، S. M. & amp La Thangue، N. B. التنوع داخل مسار pRb: هل توجد مدونة سلوك؟ الأورام 31, 4343–4352 (2012).

Knudsen ، E. S. & amp Wang ، J. Y. التنظيم التفاضلي لوظيفة بروتين الورم الأرومي الشبكي عن طريق مواقع الفسفرة Cdk المحددة. J. بيول. تشيم. 271, 8313–8320 (1996).

Harbour، J.، Luo، R.، Dei Santi، A.، Postigo، A. & amp Dean، D. Cdk phosphorylation يطلق تفاعلات داخل الجزيئية متسلسلة تمنع وظائف Rb تدريجياً بينما تتحرك الخلايا عبر G1. زنزانة 98, 859–869 (1999).

إسحاق ، سي إي وآخرون. ينظم بروتين الورم الأرومي الشبكي الهيتروكروماتين المحيط بالمركز. مول. زنزانة. بيول. 26, 3659–3671 (2006).

تلوري ، س وآخرون. نقطة تفتيش G1 بوساطة بروتين الورم الأرومي الشبكي الذي يمكن الاستغناء عنه في التمايز النهائي ولكنه ضروري للشيخوخة. مول. زنزانة. بيول. 30, 948–960 (2010).

تشيكاس ، إيه وآخرون. تشريح الدور الفريد لقمع ورم الشبكية أثناء الشيخوخة الخلوية. الخلايا السرطانية 17, 376–387 (2010). يحدد أهداف E2F الدقيقة للقمع المعتمد على RB في الشيخوخة عن طريق الترسيب المناعي للكروماتين متبوعًا بنهج التسلسل والمصفوفة الدقيقة.

Dannenberg ، J.-H. ، van Rossum ، A. ، Schuijff ، L. & amp te Riele ، H. يحرر استئصال عائلة الجينات الورم الأرومي الشبكي من التحكم في G1 مما يتسبب في الخلود وزيادة معدل دوران الخلايا في ظل ظروف تقييد النمو. تطوير الجينات. 14, 3051–3064 (2000).

سيج ، جيه وآخرون. يؤدي التعطيل المستهدف للجينات الثلاثة المرتبطة بـ Rb إلى فقدان التحكم في G1 والخلود. تطوير الجينات. 14, 3037–3050 (2000).

بورجو ، آر جيه وآخرون. يقيد RB تكوين الأورام الناتج عن تلف الحمض النووي من خلال آلية تعتمد على LXCXE للتحكم في النسخ. مول. زنزانة 43, 663–672 (2011).

Moberg ، K. ، Starz ، M.A & amp Lees ، J.A E2F-4 التبديل من p130 إلى p107 و pRB استجابةً لإعادة دخول دورة الخلية. مول. زنزانة. بيول. 16, 1436–1449 (1996).

Hurford و R.K Jr و Cobrinik و D. و Lee و M.H & amp Dyson و N. pRB و p107 / p130 مطلوبة للتعبير المنظم لمجموعات مختلفة من الجينات المستجيبة لـ E2F. تطوير الجينات. 11, 1447–1463 (1997).

كام ، هـ وآخرون. تربط مجموعة مشتركة من شبكات تنظيم الجينات عملية التمثيل الغذائي وتثبيط النمو. مول. زنزانة 16, 399–411 (2004).

Litovchick ، ​​L. et al. يقوم مركب البروتين RBL2 / p130 و E2F4 المحفوظ تطوريًا بقمع الجينات التي تعتمد على دورة الخلية البشرية في هدوء. مول. زنزانة 26, 539–551 (2007).

كورينجاك ، إم وآخرون. تحتوي مجمعات E2F / RBF الأصلية على بروتينات تتفاعل مع Myb وتقمع نسخ الجينات المستهدفة التي يتم التحكم فيها من خلال النمو. زنزانة 119, 181–193 (2004).

Litovchick، L.، Florens، L. A.، Swanson، S. K.، Washburn، M. P. & amp DeCaprio، J. A. DYRK1A protein kinase يعزز الهدوء والشيخوخة من خلال تجميع مجمع DREAM. تطوير الجينات. 25, 801–813 (2011)

يتفاعل Pilkinton ، M. ، Sandoval ، R. & amp Colamonici ، O. ذبابة الفاكهة مجمع الحلم. الأورام 26, 7535–7543 (2007).

Sadasivam ، S. ، Duan ، S. & amp DeCaprio ، J. A. يقوم مجمع MuvB بتجنيد B-Myb و FoxM1 بالتسلسل لتعزيز التعبير الجيني الانقسامي. تطوير الجينات. 26, 474–489 (2012).

هاناهان ، د. وأمبير واينبرغ ، ر. أ. السمات المميزة للسرطان. زنزانة 100, 57–70 (2000).

تشين ، د. وآخرون. تقسيم وموت الخلايا المبرمج من أسلاف شبكية عيب E2f. طبيعة سجية 462, 925–929 (2009). يكشف عن النتيجة المفاجئة التي مفادها أن بروتينات عائلة E2F المنشط يمكن الاستغناء عنها للتكاثر في شبكية العين النامية.

تشونغ ، جيه إل وآخرون. E2f1–3 التبديل من المنشطات في الخلايا السلفية إلى المثبطات في الخلايا المتمايزة. طبيعة سجية 462, 930–934 (2009). يوضح التناقض القائل بأن المنشط E2Fs مطلوب فقط للقمع وخروج دورة الخلية في الأمعاء.

جي ، ب وآخرون. يتوسط مسار Rb - Skp2 - p27 تثبيط دورة الخلية الحادة بواسطة Rb ويتم الاحتفاظ به في طفرة Rb ذات الاختراق الجزئي. مول. زنزانة 16, 47–58 (2004).

جاو ، د. وآخرون. ينظم Cdh1 دورة الخلية من خلال تعديل مسارات claspin / Chk1 و Rb / E2F1. مول. بيول. زنزانة 20, 3305–3316 (2009).

وانج هـ وآخرون. مطلوب Skp2 للبقاء على قيد الحياة للخلايا التي تتكاثر بشكل شاذ Rb1 وتكوين الأورام في Rb1 +/− الفئران. طبيعة الجينات. 42, 83–88 (2010). يقرر أن نقص SKP2 يعمل على استقرار التعبير عن p27 ويمنع تكون الأورام في ر +/− الفئران.

Schvartzman ، J.M ، Duijf ، P. H. ، Sotillo ، R. ، Coker ، C. & amp Benezra ، R. Mad2 هو وسيط حاسم لعدم استقرار الكروموسوم الذي لوحظ عند تثبيط مسار Rb و p53. الخلايا السرطانية 19, 701–714 (2011).

Kabeche، L. & amp Compton، D. A. التثبيت المستقل عن نقطة التفتيش لمرفقات الأنابيب الحركية الدقيقة بواسطة Mad2 في الخلايا البشرية. بالعملة. بيول. 22, 638–644 (2012).

بيستر ، إيه سي وآخرون. يعزز نقص النوكليوتيدات عدم الاستقرار الجيني في المراحل المبكرة من تطور السرطان. زنزانة 145, 435–446 (2011). يوضح أن فقدان وظيفة RB يؤدي إلى نقص النوكليوتيدات وتكرار الحمض النووي الشاذ.

غونزالو ، إس وآخرون. دور عائلة RB1 في تثبيت ميثلة هيستون في الهيتروكروماتين التأسيسي. خلية الطبيعة بيول. 7, 420–428 (2005).

Benetti، R. et al. ينتج عن نقص Suv4-20h استطالة التيلومير وإلغاء تأشيب التيلومير. J. خلية بيول. 178, 925–936 (2007).

Manning, A. L., Longworth, M. S. & Dyson, N. J. Loss of pRB causes centromere dysfunction and chromosomal instability. تطوير الجينات. 24, 1364–1376 (2010). Shows that RB controls centromere structure and function and that in its absence mitotic errors lead to aneuploidy.

Coschi, C. H. et al. Mitotic chromosome condensation mediated by the retinoblastoma protein is tumor-suppressive. تطوير الجينات. 24, 1351–1363 (2010). Demonstrates, using a knock-in mutant of RB, that defective chromosome condensation contributes to cancer pathogenesis.

van Harn, T. et al. Loss of Rb proteins causes genomic instability in the absence of mitogenic signaling. تطوير الجينات. 24, 1377–1388 (2010). Shows that deletion of all three RB-family proteins causes chromosomal breaks and aneuploidy.

تشانغ ، ج. وآخرون. A novel retinoblastoma therapy from genomic and epigenetic analyses. طبيعة سجية 481, 329–334 (2012).

Trimarchi, J. M. & Lees, J. A. Sibling rivalry in the E2F family. Nature Rev. Mol. خلية بيول. 3, 11–20 (2002).

Wu, L. et al. Extra-embryonic function of Rb is essential for embryonic development and viability. طبيعة سجية 421, 942–947 (2003).

Ianari, A. et al. Proapoptotic function of the retinoblastoma tumor suppressor protein. الخلايا السرطانية 15, 184–194 (2009). Reveals that phosphorylated RB participates in a transcriptional activation mechanism that drives the expression of apoptotic target genes in response to DNA damage.

Helin, K. et al. A cDNA encoding a pRB-binding protein with properties of the transcription factor E2F. زنزانة 70, 337–350 (1992).

Seifried, L. A. et al. pRB–E2F1 complexes are resistant to adenovirus E1A-mediated disruption. J. Virol. 82, 4511–4520 (2008).

Cecchini, M. J. & Dick, F. A. The biochemical basis of CDK phosphorylation-independent regulation of E2F1 by the retinoblastoma protein. بيوتشيم. ج. 434, 297–308 (2011).

Wells, J., Yan, P. S., Cechvala, M., Huang, T. & Farnham, P. J. Identification of novel pRb binding sites using CpG microarrays suggests that E2F recruits pRb to specific genomic sites during S phase. الأورام 22, 1445–1460 (2003).

Avni, D. et al. Active localization of the retinoblastoma protein in chromatin and its response to S phase DNA damage. مول. زنزانة 12, 735–746 (2003).

Calbo, J. et al. G1 cyclin/cyclin-dependent kinase-coordinated phosphorylation of endogenous pocket proteins differentially regulates their interactions with E2F4 and E2F1 and gene expression. J. بيول. تشيم. 277, 50263–50274 (2002).

Carnevale, J., Palander, O., Seifried, L. A. & Dick, F. A. DNA damage signals through differentially modified E2F1 molecules to induce apoptosis. مول. زنزانة. بيول. 32, 900–912 (2012).

Bosco, E. E. et al. The retinoblastoma tumor suppressor modifies the therapeutic response of breast cancer. J. كلين. استثمار. 117, 218–228 (2007).

Hallstrom, T. C., Mori, S. & Nevins, J. R. An E2F1-dependent gene expression program that determines the balance between proliferation and cell death. الخلايا السرطانية 13, 11–22 (2008).

Irwin, M. S. et al. Chemosensitivity linked to p73 function. الخلايا السرطانية 3, 403–410 (2003).

Carr, S. M., Munro, S., Kessler, B., Oppermann, U. & La Thangue, N. B. Interplay between lysine methylation and Cdk phosphorylation in growth control by the retinoblastoma protein. EMBO J. 30, 317–327 (2011).

Chan, H. M., Krstic-Demonacos, M., Smith, L., Demonacos, C. & La Thangue, N. B. Acetylation control of the retinoblastoma tumour-suppressor protein. طبيعة الجينات. 3, 667–674 (2001).

Markham, D., Munro, S., Soloway, J., O'Connor, D. P. & La Thangue, N. B. DNA-damage-responsive acetylation of pRb regulates binding to E2F-1. EMBO Rep. 7, 192–198 (2006).

Munro, S., Khaire, N., Inche, A., Carr, S. & La Thangue, N. B. Lysine methylation regulates the pRb tumour suppressor protein. الأورام 29, 2357–2367 (2010).

Saddic, L. A. et al. Methylation of the retinoblastoma tumor suppressor by SMYD2. J. بيول. تشيم. 285, 37733–37740 (2010).

Henley, S. A. & Dick, F. A. The retinoblastoma family of proteins and their regulatory functions in the mammalian cell division cycle. Cell Div. 7, 10 (2012).

Cobrinik, D. Pocket proteins and cell cycle control. الأورام 24, 2796–2809 (2005).

Jacks, T. et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. طبيعة سجية 359, 295–300 (1992).

Lee, M. H. et al. Targeted disruption of p107: functional overlap between p107 and Rb. تطوير الجينات. 10, 1621–1632 (1996).

Cobrinik, D. et al. Shared role of the pRB-related p130 and p107 proteins in limb development. تطوير الجينات. 10, 1633–1644 (1996).

Lamber, E.P. وآخرون. Structural insights into the mechanism of phosphoregulation of the retinoblastoma protein. بلوس واحد 8, e58463 (2013).


المواد والأساليب

Strains and culture conditions

Stock d4-2 of ص. tetraurelia, the wild-type reference strain, was used in all feeding experiments. The nd7-1 mutant, carrying a recessive monogenic mutation preventing trichocyst discharge [82], was used for the expression of GFP fusions. Cells were grown at 27°C in a wheatgrass infusion (BHB, GSE Vertrieb, Germany), bacterized with الكلبسيلة الرئوية, and supplemented with 0.8 μg/ml β-sitosterol according to standard procedures [83].

Gene cloning

Genomic DNA was amplified by PCR, using specific primers (given in S3 Table) in order to fuse the TZ genes to the GFP coding sequence in the pPXV vector, between Speانا و زهوأنا المواقع المقيدة. If these restriction sites were present in the sequence to be cloned, we used the Gibson cloning method [84]. For gene silencing constructs, sequences of interest were designed for their ability to inactivate all the paralogs, if possible with the help of RNAi off-target tools in ParameciumDB [85] to prevent RNAi off-target. The sequences were cloned into the feeding vector, L4440, between two T7 promoters [86].


مقدمة

Vectorial protein transport between the ER and Golgi complex requires the coordinated action of many different small GTP-binding proteins of the Ras superfamily, each controlling distinct aspects of the cargo sorting, vesicle formation and vesicle fusion processes (Bonifacino and Glick, 2004 Zerial and McBride, 2001). These GTP-binding proteins share a common mode of action involving the recruitment of cytosolic protein complexes to localized domains on membrane surfaces (Munro, 2002 Short et al., 2005). Sar1 and ARF1 recruit COPII and COPI coat complexes to ER and Golgi membranes, respectively, thus promoting vesicle formation (Bonifacino and Glick, 2004). Rabs recruit protein complexes important for directed vesicle movement and target recognition (Pfeffer, 1999 Waters and Hughson, 2000). To do this, these proteins cycle between a GDP bound inactive state, and a GTP bound membrane-associated active state (Pfeffer and Aivazian, 2004 Vetter and Wittinghofer, 2001). It is this GTP bound state that makes specific interactions with so-called effector complexes, and thus promotes their recruitment to membranes. This cycle of activation and inactivation is under the control of GDP-GTP exchange factors (GEFs) and GAPs (Pfeffer and Aivazian, 2004 Zerial and McBride, 2001).

In the case of ER to Golgi trafficking, Rab1 and Rab2 have been implicated in the tethering and fusion reactions, and are thought to act sequentially (Allan et al., 2000 Alvarez et al., 1999 Segev, 1991 Tisdale and Balch, 1996 Tisdale et al., 1992). First, COPII vesicles, formed from specialized exit sites on the endoplasmic reticulum (ER exit sites: ERES), are tethered together by the action of Rab1 together with its effector p115 to give rise to vesicular-tubular clusters (VTCs) adjacent to the Golgi (Allan et al., 2000 Alvarez et al., 1999 Bannykh et al., 1996 Cao et al., 1998). TRAPP, the GEF for Rab1, promotes tethering of COPII vesicles by activating Rab1 and also serves as a structural component of the tether (Barrowman et al., 2000 Jones et al., 2000 Sacher et al., 2001 Wang et al., 2000). Recent evidence shows that TRAPP is assembled onto forming COPII vesicles by direct interaction with the coat, thus providing a mechanism to ensure all vesicles can recruit active Rab1 (Cai et al., 2007). Second, Rab2 and its effectors promote the maturation of these VTC structures and their incorporation into the Golgi (Short et al., 2001 Tisdale and Balch, 1996). Finally, in addition to its role in COPII vesicle tethering, Rab1 may also have a function in regulating the exit of secretory cargo from the ER. This idea arose from experiments showing that extraction of Rabs using the Rab chaperone GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) prevented the exit of the vesicular stomatitus virus G-protein (VSV G) from the ER and that this could be complemented by a complex of Rab1 and GDI (Peter et al., 1994). Later, Ypt1 and Uso1, the yeast homologues of Rab1 and p115, respectively, were found to play a role in coupling the sorting of secretory cargo to vesicle formation (Morsomme and Riezman, 2002), providing further support for this idea.

To determine which specific Rabs are of general importance for ER to Golgi trafficking and Golgi organization in mammalian cells, we have screened 38 human Rab GAPs for their ability to disrupt the organization of the Golgi complex and protein transport. Rab GAPs are characterized by a conserved catalytic domain, the TBC (Tre2/Bub2/Cdc16) domain (Albert and Gallwitz, 1999 Albert et al., 1999 Strom et al., 1993), that promotes GTP hydrolysis by a dual arginine-glutamine-finger catalytic mechanism related to the arginine-finger mechanism of Ras GAPs (Ahmadian et al., 1997 Albert et al., 1999 Pan et al., 2006 Rak et al., 2000). As we have shown previously, in the case of Rab5 (Haas et al., 2005), Rab GAPs can be used to specifically inactivate the endogenous pool of a Rab and thus interfere with the process that this Rab is involved in. By mutating the catalytic arginine residue of the TBC domain to alanine, the non-specific effects of GAP expression can easily be discriminated from the specific effects of Rab inactivation (Haas et al., 2005).


مراجع

  1. Manufacturing Chemists Association: Laboratory Waste Disposal Manual. Revised August 1975 MCA 1825 Connecticut Avenue, Washington DC 20009
  2. U.S. DHEW/P.H.S/NIH/NCI Effective use of the Laminar Flow Biological Safety Cabinet NCI, Bethesda, MD
  3. APIC (Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology) “Guidelines for Selection and Use of Disinfectants” reprint from American Journal of Infection Control Vol. 24, No. 4, pp. 313-342, August 1996.
  4. Davis, B.D. Dulbecco, R., Eisen, H.N. et al Microbiology, Third Edition (1980) Harper and Row Hagerstown, MD
  5. Joklik W.K., Willet, H.P. Zinsser Microbiology 18 th Edition 1984 Appleton Century- Crofts/ New York
  6. Block, S.S. Disinfection, Sterilization and Preservation 5 th Edition (2000) Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia
  7. Pelczar, M.J. Reid, R.D., Chan, E.C.S. Microbiology, 4 th Edition (1977) McGraw Hill Book Company, New York
  8. Kruse, R.H. Puckett, William H. “Biological Safety CabinetryClinical Microbiological Reviews Vol 4 (2), pp 207-241 (1991) American Society for Microbiology, Washington, D.C.
  9. WHO Infection Control Guidelines for Transmissible Spongiform Encephalopathies, Geneva, Switzerland, 23-26 March 1999.
Environmental Health & Safety

1000 Regent Drive
413 UCB
جامعة كولورادو
Boulder, CO 80309


المقدمة

WDR5 is a highly-conserved WD40-repeat protein that participates in numerous chromatin-centric processes. Its most prominent role is in scaffolding the assembly of epigenetic ‘writer’ complexes, including the MLL/SET histone methyltransferases (HMTs) that catalyze histone H3 lysine 4 (H3K4) di- and tri-methylation (me2,3), and the non-specific lethal (NSL) and Ada2-containing (ATAC) histone acetyltransferase (HAT) complexes that acetylate histone H4 at lysine 16 (H4K16) ( 1). But WDR5 also functions as an epigenetic ‘reader’, recognizing specific post-translational modifications on histone H3 ( 2, 3), it features in the genetic compensation response ( 4), and it serves as a critical co-factor for the retinoic acid receptor ( 5) and for the MYC family of oncoprotein transcription factors ( 6–9). The many and disparate functions of WDR5 in the nucleus clearly establish its moonlighting capabilities ( 10), but also hamper a fundamental prehension of the protein, making it difficult to establish the predominant biological setting in which WDR5 operates.

Difficulties in pinpointing a clear biologic role for WDR5 are not just conceptual, as WDR5 has emerged as a promising target for anti-cancer therapies ( 11). The motivation for targeting WDR5 is based on its overexpression in multiple cancers ( 12–20), its involvement in malignant processes such as the epithelial to mesenchymal transition ( 21) and cell motility ( 22), and its ties to oncogenic drivers such as MLL-fusion oncoproteins ( 23) and MYC ( 6–9). To date, drug discovery efforts have centered on targeting the ‘WIN’ site of WDR5 ( 10), a deep pocket that binds arginine-containing motifs (consensus ‘ARA’) present in a number of key WDR5-interaction partners, including histone H3 ( 24), KANSL1 [NSL complex ( 25)], and all five MLL/SET family members ( 24). With regard to the latter, the actions of WIN site inhibitors against cancer cell lines have generally been attributed to their ability to inhibit H3K4 methylation via MLL1-containing HMT complexes, which in turn drives decreases in the expression of linked genes ( 23, 26, 27). But with the relatively long time-frame over which mechanism of action studies have been performed, skepticism as to whether changes in H3K4 methylation would even cause changes in transcription ( 28), and the absence of a coherent biological framework for understanding WDR5, the true mode of action of WIN site inhibitors in cancer cells is uncertain.

Recently, we discovered potent small molecule inhibitors of the WIN site of WDR5 and determined their mechanism of cell inhibition in the human Mixed Lineage Leukemia (MLL) cell line MV4:11, which carries the MLL–AF4 fusion oncogene ( 29, 30). This study produced several surprising findings. First, despite the general association of H3K4me3 with transcriptionally active chromatin ( 28), WDR5 binds to just ∼160 sites on chromatin in this setting, as measured by chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-Seq). Although the instances of WDR5 binding are small, the sites involved are strongly enriched in genes connected to protein synthesis (protein synthesis genes PSGs), and encompass half of the ribosome protein genes (RPGs), as well as translation initiation factors and nucleolar components. Second, WIN site inhibitors act rapidly to displace WDR5 from chromatin and diminish transcription from WDR5-bound PSGs, and do so before changes in H3K4me3 status are detected. And third, WIN site inhibitors decrease the protein synthesis capacity of MV4:11 cells, induce nucleolar stress, and activate p53-mediated apoptosis. From these data, we proposed that WDR5 is tethered to chromatin at PSGs via the WIN site, and that WIN site inhibitors act through a primary non-epigenetic mechanism to trigger an ultimately lethal nucleolar stress response in sensitive cell lines.

Although empirical tests of cancer cell sensitivity can be informative, a detailed knowledge of the conserved gene networks controlled by WDR5, and the role of the WIN site in this context, is needed to meaningfully evaluate the potential of WDR5 inhibition as an anti-cancer strategy. It is thus important to establish whether the behavior of WDR5 in MV4:11 cells is atypical, or reflects more general unappreciated aspects of the role WDR5 plays in cells. In this study, we compare the location of WDR5 on chromatin in a panel of mouse and human cells lines of diverse cancer types, and use a WIN site inhibitor to interrogate how WDR5 is tethered to chromatin in different contexts and to reveal the gene networks under the influence of WDR5. We find that the number and location of WDR5 binding sites on chromatin across different cell lines is variable, but that there is a conserved cohort of PSGs that are invariantly bound by WDR5 via the WIN site and transcriptionally repressed by WIN site inhibition. These studies define WDR5 as a conserved regulator of gene networks that promote biomass accumulation, and support the notion that—if a therapeutic window can be established—drug-like WIN site inhibitors could have utility as triggers of nucleolar surveillance and ribosome quality control pathways in cancer cells.


مناقشة

Ribosome production is an essential process during neoplastic transformation. Regulation of cellular growth and proliferation mainly depends on the rate of ribosomal biogenesis. Cancer cells required increased production of ribosomes to sustain their high demand for protein synthesis. Protein synthesis requires ribosomal RNAs besides the protein components of the translation machinery [6].

The underlying molecular mechanisms of ribosomal modifications in various human diseases including malignancy are diverse and not fully understood [32,33,34]. Previous studies on neuroblastoma and lymphocytic leukemia demonstrated that snoRNP signature displayed highly significant prognostic value and was an independent predictor of poor prognosis through its effect on genomic stability and telomere maintenance [10, 11].

NOP10 is one of four essential protein components of H/ACA snoRNPs, which plays a potential role in facilitating the modification and stabilization of ribosomal RNAs. In addition, NOP10 is required for optimal enzymatic activity [35].

To further explore the potential value of snoRNPs family, we investigated for the first time, to the best our knowledge, the prognostic and predictive significance of NOP10 in BC using genomic, transcriptomic, and proteomic data of large BC cohorts. NOP10 protein expression was assessed in the nuclei and nucleoli of BC cells to determine its association with the nucleolar score [4].

The number and size of nucleoli as a consequence of its elevated activity in ribosomal biogenesis has been widely used as a prognostic marker of aggressive cancer [4, 36]. In the current study, a significant association between high NOP10 at both level protein (whether in nucleus or nucleoli) and mRNA expression (transcriptomic) with the nucleolar score (phenotype) was observed. These findings may support the speculation that NOP10 expression correlates with nucleoli appearance and size through its functional role in ribosomal RNA modification.

We revealed the significant association between the high expression of NOP10, at both protein and mRNA levels, and poor prognostic clinicopathological parameters and worse survival supporting its importance in BC progression. These data are in accordance with a study which showed alterations in NOP10 mRNA are associated with poor prognosis in endometrial cancer [37]. Moreover, we demonstrated a significant association between NOP10 mRNA expression and CN variation which supports the idea that hypotheses the diverging expression of snoRNPs could be closely associated with an overall elevation in genetic aberrations in BC [10, 38]. We reported a higher percentage in NOP10 expression at the proteomic level compared to the mRNA level, this could be related to sample fixation, age of stored samples or the specificity of antigen retrieval technique [39, 40]. Also, transcriptomic data reflects the mRNA level of all cells within the tissue samples either tumour cells or other surrounding cells.

We also evaluated the association of NOP10 and BC subtypes. NOP10 protein expression was significantly associated with shorter DMFS and BCSS in TNBC, while mRNA predicted poor outcome in HER2+ tumours. Such discrepancies might be attributed to the differences in the number of cases in each subtype between the Nottingham and METABRIC cohorts or might be due to tumour-specific differences in NOP10 mRNA/protein stability or post-transcriptional regulation of NOP10 expression.

NOP10 protein expression was independent prognostic markers in all cases and in TNBC, which may have potential clinical relevance in improving survival rate prediction. TNBC is highly malignant, prone to metastasis and relapse, and significantly correlated with a poorer prognosis and a greater risk of mortality comparing to other BC subtypes [41, 42]. NOP10 elevation is doubtlessly attributable to TNBC aggressive character through its heavier protein requirements for cell survival and proliferation which is compatible with increased rRNA synthesis [43]. This implies that NOP10 plays a role in tumourigenic pathways and could be a marker of poor prognosis in TNBC.

Since high expression of NOP10 was associated with worse prognostic features and outcome in patients with TNBC subtype, we hypothesized that NOP10 may play an important role in response to chemotherapy. Our findings showed that patients with high NOP10 expression showed poorer outcome than those with low levels of NOP10 even when chemotherapy was received which indicates that NOP10 could potentially contribute to chemotherapy resistance. These findings suggest that assessment of NOP10 expression prior to adjuvant treatment could predict the chemotherapy resistance and eventually tumour relapse.

NOP10 plays a critical role for the stability of the domain as well as in the assembly and integrity of H/ACA snoRNPs complexes (DKC1, NHP2, NOP10 & GAR1), where they implicated mainly in the isomerization of uridine to pseudouridine thereby, promote the folding and stabilization of RNAs, such as the local RNA structure in the ribosome [44]. The current study confirmed the correlation among the gene expressions of all H/ACA ribonucleoproteins. High NOP10 protein expression was correlated with the high level of DKC1, indicating a system of functional coupling between these biomarkers at the protein level in isomerization and stabilization of RNAs.

Biogenesis of H/ACA snoRNPs is regulated in response to high demands for protein synthesis and c-Myc plays a crucial role in regulating cellular growth, size, and protein synthesis. Our study revealed a positive significant relationship between NOP10 and c-Myc. Therefore, it can be speculated that modulation of c-Myc transcriptional activity may regulate NOP10 expression in order to fulfil increased demands for protein synthesis that is highly required to maintain the proliferation and self-renewal of tumour cells [45,46,47].

TP53 mutations were also highly prevalent in breast tumours where there was high NOP10 mRNA expression. Marcel et al. have demonstrated that the level of rRNA methylation usually increased in cancer cells with dysfunctional p53, substantially elucidating that rRNA modifications contribute to the tumourigenic process. The high level of rRNA methylation resulted in initiating protein translation through a process called internal ribosome entry sequences (IRESs) which resulted in products that promote tumour development (The insulin-like growth factor 1 (IGF-1R), c-Myc, Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and acidic fibroblast growth factor (FGF1)) [47,48,49].

Despite the remarkable results this study presents, there are some identified limitations. The subjectivity of the semi-quantitative H-score method, that has been used to score the sections, is one of our study weaknesses. It was aimed to reduce the impact of this limitation by allowing two well-trained observers to score about 10% of the cores to ensure the reproducibility and liability of the procedure. On the other hand, using TMA could underestimate the role of tumour heterogeneity.

In conclusion, our study revealed the prognostic and predictive importance of NOP10 in BC. NOP10 was associated with poor prognostic characteristics and poor survival outcome. Overexpression of NOP10 appears to play a role in the progression of TNBC and is potentially predictive for selecting patients who might develop resistance to chemotherapy. Thus, it could act as a potential prognostic marker and a therapeutic target. Functional assessment is warranted to reveal the specific role played by NOP10 in the BC, especially in the highly proliferative molecular subtypes.


شاهد الفيديو: الخضروات و الفواكه. استخدام مكمل البروتين شيك. مصادر البروتين الكامله وغير الكاملة (قد 2022).


تعليقات:

  1. Shaaban

    هنا! بالضبط!

  2. Jonatan

    مرحبًا ، ذهبت إلى مشروعك من Yandex وبدأت Kaspersky في التقسيم في الفيروسات = ((

  3. Daniachew

    يا لها من كلمات عظيمة

  4. Aiekin

    انت على حق تماما. هناك شيء في هذا وأعتقد أن هذه فكرة رائعة للغاية. اتفق معك تماما.



اكتب رسالة