معلومة

تكاثر الحمض النووي في E.coli $

تكاثر الحمض النووي في E.coli $


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كولاي $ يحتوي على حمض نووي دائري أعتقد أنه يشير إلى أن أحد الخيطين يشكل الدائرة الخارجية والآخر يشكل الدائرة الداخلية. إذن ، هل هناك طريقة لمعرفة ما إذا كان الحمض النووي المكرر يشكل الدائرة الخارجية أم الداخلية؟ في الصورة المرفقة ، يُرى أن الحمض النووي المكرر يشكل الدائرة الداخلية. مذكور أيضًا حقيقة أنه لا يمكن تكوين خيوط فردية بواسطة TEM.


14.4 تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • اشرح عملية تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى
  • ناقش دور الإنزيمات والبروتينات المختلفة في دعم هذه العملية

تمت دراسة تكاثر الحمض النووي جيدًا في بدائيات النوى في المقام الأول بسبب صغر حجم الجينوم وبسبب التنوع الكبير للطفرات المتوفرة. بكتريا قولونية يحتوي على 4.6 مليون زوج قاعدي في كروموسوم دائري واحد ويتم تكرار كل ذلك في حوالي 42 دقيقة ، بدءًا من موقع واحد على طول الكروموسوم ويستمر حول الدائرة في كلا الاتجاهين. هذا يعني أنه يتم إضافة ما يقرب من 1000 نيوكليوتيد في الثانية. وبالتالي ، فإن العملية سريعة جدًا وتحدث بدون أخطاء كثيرة.

يستخدم تكرار الحمض النووي عددًا كبيرًا من البروتينات والإنزيمات الهيكلية ، يلعب كل منها دورًا مهمًا أثناء العملية. إن الإنزيم هو أحد اللاعبين الرئيسيين بوليميريز الحمض النووي، المعروف أيضًا باسم DNA pol ، والذي يضيف النيوكليوتيدات واحدًا تلو الآخر إلى سلسلة الحمض النووي المتنامية التي تكون مكملة لقالب القالب. تتطلب إضافة النيوكليوتيدات طاقة يتم الحصول عليها من النوكليوزيد ثلاثي الفوسفات ATP و GTP و TTP و CTP. مثل ATP ، والآخر NTPs (nucleoside triphosphates) عبارة عن جزيئات عالية الطاقة يمكن أن تعمل كمصدر لنيوكليوتيدات الحمض النووي ومصدر للطاقة لدفع البلمرة. عندما "تنكسر" الرابطة بين الفوسفات ، يتم استخدام الطاقة المنبعثة لتشكيل رابطة الفوسفوديستر بين النوكليوتيدات الواردة وسلسلة النمو. في بدائيات النوى ، تُعرف ثلاثة أنواع رئيسية من البوليميرات: DNA pol I و DNA pol II و DNA pol III. من المعروف الآن أن DNA pol III هو الإنزيم المطلوب لتخليق الحمض النووي DNA pol I هو إنزيم ملحق مهم في تكرار الحمض النووي ، وإلى جانب DNA pol II ، مطلوب بشكل أساسي للإصلاح.

كيف تعرف آلية النسخ من أين تبدأ؟ اتضح أن هناك تسلسلات محددة من النوكليوتيدات تسمى أصول النسخ المتماثل حيث يبدأ النسخ المتماثل. في بكتريا قولونية، الذي له أصل واحد من النسخ المتماثل على كروموسومه الواحد (كما هو الحال مع معظم بدائيات النوى) ، يبلغ أصل هذا النسخ المتماثل حوالي 245 زوجًا أساسيًا وغنيًا بتسلسلات AT. يتم التعرف على أصل النسخ المتماثل بواسطة بروتينات معينة ترتبط بهذا الموقع. انزيم يسمى هيليكس يفك الحمض النووي عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القاعدة النيتروجينية. التحلل المائي ATP مطلوب لهذه العملية. عندما ينفتح الحمض النووي ، تسمى الهياكل على شكل Y شوك النسخ المتماثل تتشكل. يتم تشكيل اثنين من شوكات النسخ المتماثل في أصل النسخ المتماثل ويتم تمديدهما ثنائي الاتجاه مع استمرار النسخ المتماثل. تقوم بروتينات الربط أحادية الخيط بتغطية خيوط الحمض النووي المفردة بالقرب من شوكة النسخ المتماثل لمنع الحمض النووي أحادي السلسلة من الالتفاف مرة أخرى إلى حلزون مزدوج.

يحتوي بوليميريز الحمض النووي على قيدين مهمين: فهو قادر على إضافة النيوكليوتيدات فقط في اتجاه 5 'إلى 3' (يمكن تمديد خيط DNA الجديد فقط في هذا الاتجاه). يتطلب أيضًا مجموعة 3'-OH مجانية يمكن أن تضيف إليها النيوكليوتيدات عن طريق تكوين رابطة فوسفوديستر بين نهاية 3'-OH و 5 'فوسفات من النيوكليوتيدات التالية. هذا يعني بشكل أساسي أنه لا يمكن إضافة النيوكليوتيدات إذا لم تكن مجموعة 3-OH مجانية متاحة. ثم كيف تضيف النوكليوتيدات الأولى؟ تم حل المشكلة بمساعدة البرايمر الذي يوفر نهاية مجانية 3'-OH. يقوم إنزيم آخر ، وهو RNA primase ، بتجميع جزء من RNA يبلغ طوله حوالي خمسة إلى عشرة نيوكليوتيدات ومكمل لقالب الحمض النووي. لأن هذا التسلسل يهيئ تركيب الحمض النووي ، فإنه يسمى بشكل مناسب التمهيدي. يمكن الآن لبوليميراز الحمض النووي أن يمد هذا التمهيدي من الحمض النووي الريبي ، مضيفًا النيوكليوتيدات واحدة تلو الأخرى التي تكمل حبلا القالب (الشكل 14.14).

اتصال مرئي

سؤال: تقوم بعزل سلالة خلوية يكون فيها التحام شظايا أوكازاكي معطوبًا وتشك في حدوث طفرة في إنزيم موجود في شوكة النسخ المتماثل. ما هو الإنزيم الأكثر احتمالية للطفرة؟

تتحرك شوكة النسخ بمعدل 1000 نيوكليوتيد في الثانية. يمنع Topoisomerase الالتفاف المفرط للحلزون المزدوج للحمض النووي قبل شوكة النسخ حيث أن الحمض النووي ينفتح يفعل ذلك عن طريق التسبب في شقوق مؤقتة في حلزون الحمض النووي ثم إعادة ختمه. لأن بوليميراز الحمض النووي يمكن أن يمتد فقط في اتجاه 5 'إلى 3' ، ولأن الحلزون المزدوج للحمض النووي موجود مضاد، هناك مشكلة بسيطة في شوكة النسخ المتماثل. تحتوي خيوط DNA النموذجية على اتجاهات متعارضة: خصلة واحدة في اتجاه 5 'إلى 3' والأخرى موجهة في اتجاه 3 'إلى 5'. يمكن تصنيع خيط DNA جديد واحد فقط ، وهو الذي يكمل خيط DNA الأبوي من 3 إلى 5 ، بشكل مستمر نحو شوكة النسخ المتماثل. يُعرف هذا الخيط المركب باستمرار باسم الخيط الرئيسي. الشريط الآخر ، المكمل للحمض النووي الأبوي من 5 إلى 3 ، يمتد بعيدًا عن شوكة النسخ ، في أجزاء صغيرة تعرف باسم شظايا أوكازاكي ، تتطلب كل منها مادة أولية لبدء التركيب. يتم وضع مقاطع التمهيدي الجديدة في اتجاه شوكة النسخ ، ولكن كل منها يشير بعيدًا عنها. (تمت تسمية شظايا أوكازاكي على اسم العالم الياباني الذي اكتشفها لأول مرة. تُعرف الخصلة التي تحتوي على شظايا أوكازاكي باسم الخيط المتأخر).

يمكن تمديد الخيط الرئيسي من مادة أولية واحدة ، بينما يحتاج الخيط المتأخر إلى مادة أولية جديدة لكل جزء من أجزاء أوكازاكي القصيرة. سيكون الاتجاه العام للخيط المتأخر من 3 إلى 5 ، واتجاه الخيط الرئيسي من 5 إلى 3. يحافظ بروتين يسمى المشبك المنزلق على بوليميريز الحمض النووي في مكانه بينما يستمر في إضافة النيوكليوتيدات. المشبك المنزلق عبارة عن بروتين على شكل حلقة يرتبط بالحمض النووي ويثبت البوليميراز في مكانه. مع استمرار عملية التوليف ، يتم استبدال بادئات RNA بواسطة DNA. تتم إزالة المواد الأولية بواسطة نشاط نوكلياز خارجي لـ DNA pol I ، والذي يستخدم الحمض النووي خلف الحمض النووي الريبي (RNA) كتمهيدي خاص به ويملأ الفجوات التي خلفتها إزالة نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق إضافة نيوكليوتيدات الحمض النووي. يتم ختم النكات المتبقية بين الحمض النووي المركب حديثًا (الذي حل محل RNA التمهيدي) والحمض النووي المركب مسبقًا بواسطة إنزيم DNA ligase ، والذي يحفز تكوين روابط phosphodiester بين نهاية 3'-OH لنيوكليوتيد واحد و 5 ' نهاية الجزء الآخر من الفوسفات.

بمجرد أن يتم تكرار الكروموسوم بالكامل ، تنتقل نسختا الحمض النووي إلى خليتين مختلفتين أثناء انقسام الخلية.

يمكن تلخيص عملية تكرار الحمض النووي على النحو التالي:

  1. يستريح الحمض النووي عند أصل التكرار.
  2. يفتح Helicase شوكات النسخ المتماثل المكونة للحمض النووي والتي يتم تمديدها بشكل ثنائي الاتجاه.
  3. تقوم بروتينات الربط أحادية الخيط بتغطية الحمض النووي حول شوكة النسخ المتماثل لمنع إعادة لف الحمض النووي.
  4. يرتبط Topoisomerase بالمنطقة قبل شوكة النسخ المتماثل لمنع الالتفاف الفائق.
  5. يصنع Primase مواد أولية من RNA مكملة لخيط DNA.
  6. يبدأ DNA polymerase III في إضافة النيوكليوتيدات إلى 3'-OH نهاية التمهيدي.
  7. يستمر استطالة كل من الخيط المتأخر والرائد.
  8. تتم إزالة الاشعال RNA بواسطة نشاط نوكلياز خارجي.
  9. يتم سد الثغرات بواسطة DNA pol I عن طريق إضافة dNTPs.
  10. يتم سد الفجوة بين شظي الحمض النووي بواسطة DNA ligase ، مما يساعد في تكوين روابط phosphodiester.


يلخص الجدول 14.1 الإنزيمات المشاركة في تكرار الحمض النووي بدائية النواة ووظائف كل منها.


الطرد المركزي المتدرج الكثافة

يتم طرد كمية صغيرة من الحمض النووي في محلول مركز من كلوريد السيزيوم بالطرد المركزي حتى يقترب التوازن عن كثب. أنتجت عمليات الترسيب والانتشار المتعارضة بعد ذلك تدرج تركيز ثابتًا لكلوريد السيزيوم. ينتج عن تدرجات التركيز والضغط زيادة مستمرة في الكثافة على طول اتجاه قوة الطرد المركزي. يتم دفع الجزيئات الكبيرة من الحمض النووي الموجودة في تدرج الكثافة هذا بواسطة مجال الطرد المركزي إلى المنطقة التي تكون فيها كثافة المحلول مساوية لكثافة الطفو الخاصة بها. 11 يتم معارضة اتجاه التركيز هذا من خلال الانتشار ، مما يؤدي إلى توزيع نوع واحد من الحمض النووي عند التوازن على نطاق يرتبط عرضه عكسياً بالوزن الجزيئي لتلك الأنواع (الشكل 1).

صور امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تظهر مراحل متتالية في النطاقات من الحمض النووي من بكتريا قولونية. تم طرد قسامة من المحللة البكتيرية التي تحتوي على ما يقرب من 10 8 خلايا lysed عند 31410 دورة في الدقيقة في محلول CsCl كما هو موضح في النص. تزداد المسافة من محور الدوران نحو اليمين. يشير الرقم الموجود بجانب كل صورة إلى الوقت المنقضي بعد الوصول إلى 31410 دورة في الدقيقة.

في حالة وجود عدة أنواع مختلفة الكثافة من الحمض النووي ، سيشكل كل منها نطاقًا في الموضع الذي تكون فيه كثافة محلول CsCl مساوية للكثافة الطافية لتلك الأنواع. بهذه الطريقة يمكن حل الحمض النووي المسمى بالنيتروجين الثقيل (N 15) من الحمض النووي غير المسمى. يوضح الشكل 2 النطاقين المتكونين نتيجة للطرد المركزي لمزيج من كميات متساوية تقريبًا من N 14 و N 15 الإشريكية القولونية الحمض النووي.

أ: تحليل N 14 DNA من N 15 DNA بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة. تم طرد خليط من محلول بكتيري N 14 و N 15 ، يحتوي كل منهما على حوالي 10 8 خلايا مفسدة ، في محلول CsCl كما هو موصوف في النص. التقطت الصورة بعد 24 ساعة من الطرد المركزي بسرعة 44770 دورة في الدقيقة. ب: تتبع مقياس حساسية مكروي يوضح توزيع الحمض النووي في منطقة نطاقي الشكل 2أ. يتوافق الفصل بين القمم مع اختلاف في كثافة الطفو يبلغ 0.014 جم. سم. −3

في هذه الورقة ، سيتم الإشارة إلى الوزن الجزيئي الظاهر لعينات الحمض النووي التي تم تحديدها عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. تمت مناقشة 10 من الاعتبارات التي تستند إليها هذه التحديدات ، بالإضافة إلى عدة مصادر محتملة للخطأ. 12


لائحة بروتين DnaA في بكتريا قولونية

ملخص

إنتاج ونشاط بكتريا قولونية يتم تنظيم بروتين DnaA بعدة طرق: عن طريق النسخ ، والتوطين داخل الخلايا ، والتشكيل (Katayama et al. 2010 Leonard and Grimwade 2010 Kaguni 2011). بروتين DnaA مستقر ، ولكنه خاص بدورة النسخ المتماثل الحمض النووي يعد النسخ الجيني مهمًا للحفاظ على بدء النسخ المتماثل في الوقت المناسب (Bogan and Helmstetter 1997 Riber and Løbner-Olesen 2005). يمكن تفسير ذلك من خلال دور ATP-DnaA في تنشيط البدء (Kurokawa et al. 1999 Nishida et al.2002) وفكرة أن DnaA المركب حديثًا يربط بشكل تفضيلي ATP ، والمستوى الخلوي منه أعلى بعشرة أضعاف من مستوى ADP (الشكل 3).

أيضًا ، يتطلب بدء النسخ المتماثل في الوقت المناسب أثناء دورة الخلية مناطق كروموسومية محددة تسمى DARS (تسلسل تنشيط DnaA) 1 و DARS2. تربط هذه المناطق جزيئات ADP-DnaA وتعزز تجديد ATP-DnaA عن طريق تبادل النيوكليوتيدات (الشكلان 2 و 3) (فوجيميتسو وآخرون 2009).

تم تقدير أن هناك 500-2000 جزيء DnaA لكل خلية ، اعتمادًا على خلفيات الإجهاد ومعدلات النمو (Sekimizu et al. 1988 Chiaramello and Zyskind 1989 Hansen et al. 1991a). oriC يمكنه ربط 10-20 جزيئات DnaA (Messer 2002). يمكن معايرة عدد كبير من جزيئات الحمض النووي الريبي في موضع كروموسومي محدد يسمى البيانات المطلوب لقمع أحداث البدء غير المنظمة المقاومة للريفامسيبين (الشكلان 2 و 3) (Kitagawa et al. 1998 Morigen et al. 2005).

يتقلب مستوى ATP-DnaA أثناء دورة النسخ المتماثل ، ويبلغ ذروته في وقت قريب من البدء (كوروكاوا وآخرون 1999). التحلل المائي ATP-DnaA مطلوب لتقليل مستويات ATP-DnaA بعد البدء (الشكل 3). يقترن هذا التنظيم ، المسمى RIDA (التعطيل التنظيمي لـ DnaA) ، بعمل إنزيم DNA polymerase III. RIDA أمر بالغ الأهمية لتنظيم البدء بحيث يحدث مرة واحدة فقط لكل جيل (Katayama وآخرون 1998 Kato and Katayama 2001 Su’etsugu et al. 2004 Camara et al. 2005).

تنظيم DNAA النسخ الجيني

وجد أن تركيز الحمض النووي الخلوي ثابت بغض النظر عن وسط النمو ودورة الخلية (Hansen et al. 1991a). ومع ذلك ، فإن نسخ ملفات الحمض النووي يختلف الجين بطريقة تعتمد على دورة النسخ المتماثل (Bogan and Helmstetter 1997). يبدو أن السبب الرئيسي للتذبذب هو أن الحمض النووي يتم عزل محفز الجينات بواسطة SeqA لنفس مدة الأصل تقريبًا (الشكل 3 ، الجدول 1) (Campbell and Kleckner 1990 Lu et al. 1994 Riber and Løbner-Olesen 2005). أثناء العزل ، لا يتوفر المروج لآلة النسخ. بسبب ال الحمض النووي يقع الجين بالقرب oriC، هذا يساهم في تقليل إنتاج الحمض النووي الريبي ومن ثم إمكانية البدء (أي القدرة على بدء النسخ المتماثل) بعد وقت قصير من إطلاق شوكات النسخ المتماثل الجديدة (Riber and Løbner-Olesen 2005). ال الحمض النووي تحتوي منطقة المروج أيضًا على صناديق DnaA ووجد أن المروج قادر على التنظيم التلقائي (الشكل 3 ، الجدول 1) (Messer and Weigel 1997 Hansen et al.2007). ترجمة الحمض النووي لم يتم تمييز mRNA بشكل جيد ، ولكن من المعروف أن كودون البدء ، GTG ، يعمل بشكل غير فعال في بكتريا قولونية.

إلزام DnaA بمواقع أخرى غير oriC

كما ذكرنا ، فإن بروتين DnaA لا يعمل فقط كبادئ ولكن أيضًا كبروتين منظم للجينات. يوجد حوالي 300 موقع ربط DnaA عالي التقارب وعدد كبير جدًا من المواقع منخفضة التقارب حول الكروموسوم (Kitagawa et al. 1996 Roth and Messer 1998 Hansen et al.2007). نظرًا لتكرار الكروموسوم ، يتم تكرار مواقع ربط الحمض النووي الريبي (DnaA) والمساهمة في معايرة الحمض النووي الريبي (DnaA) بعيدًا عن oriC. موقع المعايرة الرئيسي ، البياناتيقع بالقرب oriC ويتم تكرارها بعد وقت قصير من بدء التكرار (Kitagawa وآخرون ، 1996 ، 1998 Ogawa وآخرون ، 2002 Morigen et al. 2003 ، 2005). في الدراسات المجراة تشير إلى أن البيانات يرتبط الموقع بمتوسط ​​60 جزيء DnaA (Hansen et al.2007). ال البيانات يجب أن يساهم الموقع في تقليل إمكانات البدء عند oriC متي oriC لا يزال قيد الحبس. ال البيانات يبلغ حجم الموقع حوالي 1 كيلو بايت ويحتوي على خمسة مواقع ربط DnaA عالية التقارب وحوالي 25 موقعًا منخفض التقارب (الشكل 2 الجدول 1) (Kitagawa وآخرون 1996 ، 1998 Hansen وآخرون 2007). تعد مربعات DnaA 2 و 3 عالية التقارب ضرورية للربط الفعال لـ DnaA بـ البيانات. من الممكن أن يكون الحمض النووي المرتبط بهذه المواقع بمثابة نواة لمزيد من الارتباط التعاوني لـ DnaA (Ogawa et al.2002). تم محاكاة إنتاج بروتين DnaA أثناء نمو الخلايا وتوليد مواقع الارتباط مع تكرار الكروموسوم ، وكذلك عزل و RIDA في السيليكو (Hansen et al. 1991 Browning et al. 2004 Atlas et al. 2008) وقد يشير إلى أن البدء يحدث بمجرد تراكم ما يكفي من ATP-DnaA في oriC. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن الخلايا التي تحتوي على أعداد متشابهة من الأصول ومواقع ارتباط الحمض النووي الصبغي الكروموسومي ولكن ظروف نمو مختلفة لاحتواء كميات مختلفة من الحمض النووي الريبي لكل مصدر عند البدء (Torheim وآخرون 2000 Flåtten وآخرون 2009). لذلك ، على الرغم من أن إطلاق الأصل بمجرد تراكم ما يكفي من ATP-DnaA يعد نموذجًا جذابًا لتنظيم دورة الخلية ، إلا أن الفهم الكامل للتنظيم الذي يشمل ظروف النمو المختلفة لا يزال مفقودًا حتى في الميزات الجيدة بكتريا قولونية بكتيريا.

تنظيم شكل Nucleotide DnaA بواسطة DARS و Phospholipids الحمضية

بكتريا قولونية يمكن للخلايا تحويل ADP-DnaA إلى ATP-DnaA عن طريق تبادل النيوكليوتيدات (الشكل 3) (كوروكاوا وآخرون 1999 فوجيميتسو وآخرون 2009). تعزز تسلسل DARS1 و DARS2 هذا التفاعل وتقع في منتصف الطريق داخل المنطقة الجينية بينهما oriC و تيرك، على يمين ويسار oriC، على التوالي (الشكل 2 أ) (فوجيميتسو وآخرون 2009). من السمات الشائعة لـ DARS1 و DARS2 وجود مجموعة مربعات DnaA ، حيث تكون ثلاثة صناديق DnaA متشابهة الاتجاه وتقع على مسافة مماثلة (الشكل 2 ب). يمكن لجزيئات ADP-DnaA المتعددة أن تشكل مجمعات باستخدام DARS ، مما يسهل إطلاق ADP من DnaA. من المحتمل أن يتم إطلاق جزيئات apo-DnaA الناتجة من DARS بسبب انخفاض نشاط التكوين المعقد ، والذي يسمح بإعادة تنشيط ATP و DnaA. تؤدي زيادة رقم النسخة الخلوية من DARS1 أو DARS2 إلى زيادة مستوى ATP-DnaA ، مما يؤدي إلى أحداث بدء إضافية ، بينما يؤدي حذف كل من DARS1 و DARS2 إلى تأخير البدء (فوجيميتسو وآخرون ، 2009). يربط بروتين DnaA المترجم حديثًا ATP ، مما يوفر للخلايا مستوى قاعدي من ATP-DnaA. ومع ذلك ، هذا وحده لا يكفي لبدء النسخ المتماثل في الوقت المناسب. وبالتالي ، فإن وظيفة DARSs حاسمة لبدء الوقت المناسب (الشكل 3 الجدول 1). لا يزال يتعين توضيح التنظيم الوظيفي لـ DARS ، باستثناء حقيقة أن كل DARS يحتوي على منطقة تنظيمية بالإضافة إلى التسلسل المشترك الذي يحمل مجموعة مربع DnaA (Fujimitsu et al. 2009 Leonard and Grimwade 2009). بالإضافة إلى DARS ، تلعب الفسفوليبيدات الحمضية مثل كارديوليبين وفوسفاتيديل جلسرين دورًا مهمًا في إطلاق النوكليوتيدات لـ ADP-DnaA (Sekimizu and Kornberg 1988) ، ويتم إعادة تنشيط DnaA عن طريق تبادل النيوكليوتيد المرتبط في المختبر في وجود oriC و ATP (كروك وآخرون 1992). يمكن للحد من الفسفوليبيدات الحمضية في الجسم الحي أن يمنع البدء في oriC (Xia and Dowhan 1995) ، ولكن لا يزال يتعين توضيح كيفية تأثير الفسفوليبيدات الحمضية على نشاط DnaA أثناء دورة الخلية.

تنظيم DnaA Multimer Formation بواسطة DiaA

تشكل DiaA متجانسات متجانسة ويحتوي كل بروتومر على موقع محدد للارتباط بمجال DnaA I (الشكل 3) (Ishida et al. 2004 Keyamura et al.2007 ، 2009). تسمح هذه الميزات لرباعي DiaA واحد بربط جزيئات متعددة من DnaA ، والتي يمكن أن تحفز الارتباط التعاوني لـ DnaA بـ oriC ورد فعل الفك (الشكل 3 الجدول 1). ارتباط ATP-DnaA بمواقع الربط منخفضة التقارب داخل oriC تم تحسينه بواسطة DiaA (الشكل 1) (انظر Bell and Kaguni 2013 Leonard and Méchali 2013). في ضياء- الخلايا الطافرة المعطلة ، تأخر بدء النسخ المتماثل والبدء عند الأخت oriC تحدث النسخ بشكل غير متزامن في الخلايا سريعة النمو (Ishida et al. 2004 Keyamura et al.2007 ، 2009). تتوافق هذه البيانات مع الملاحظة التي مفادها أن النسخ المتماثل يبدأ بشكل غير متزامن في المسوخات التي تحمل DnaA box R4 - المحذوفة oriC (Bates et al. 1995) ، لأن ارتباط DnaA مع DnaA box R4 عالي التقارب يعزز ارتباط DnaA التعاوني بالمواقع منخفضة التقارب.

بعد DUE الاسترخاء في oriC المجمعات ، DiaA يجب أن يتم تحريرها من DnaA (Keyamura وآخرون 2009). يتم استخدام موقع ربط DiaA لمجال DnaA I أيضًا لربط DnaB heliase. ومع ذلك ، فإن آلية تفكك DiaA-DnaA لم يتم توضيحها بعد.

يتم حفظ أطباء تقويم العظام DiaA تطوريًا في الأنواع البكتيرية (Keyamura et al.2007). بالإضافة إلى ذلك ، فإن بروتين HobA هيليكوباكتر بيلوري (Hp) ، وهو عضو في ε-Proteobacteria ، يظهر تشابهًا وظيفيًا وبنيويًا مع DiaA ، على الرغم من عدم وجود تشابه كبير في التسلسل (الجدول 1) (Natrajan et al.2007 ، 2009 Zakrzewsak-Czerwinska et al.2007 Zawilak-Pawlik et al. 2007 ، 2011 Terradot et al. 2010).

تنظيم شكل Nucleotide DnaA بواسطة RIDA

بعد أن يعزز ATP-DnaA بدء النسخ المتماثل ، فإنه يتحلل بالماء بطريقة تعتمد على مركب يتكون من بروتين ADP-Hda والمشابك المحمّل بالحمض النووي (الشكل 4 ، الجدول 1) (Katayama et al. 1998 Kato and Katayama 2001 Su'etsugu وآخرون 2008). الناتج ADP-DnaA غير نشط في البدء. يسمى هذا النظام RIDA (التعطيل التنظيمي لـ DnaA). تعد RIDA أمرًا حاسمًا في تعطيل DnaA وبالتالي فهي تدعم بشكل فعال البدء مرة واحدة لكل جيل (Kurokawa et al. 1999 Camara et al. 2005 Riber et al. 2009). ال hda الجين مطلوب لتعزيز تكاثر الخلايا ، وتقليل مستويات ATP-DnaA الخلوية وقمع الإفراط في التنفيس (Kato and Katayama 2001 Fujimitsu et al. 2008 Charbon et al. 2011). حضانة حساسة لدرجة الحرارة hda تؤدي الخلايا الطافرة عند درجة الحرارة المقيدة إلى الإفراط في التكاثر وتؤدي إلى تثبيط انقسام الخلايا ، وإنتاج الخلايا الخيطية (فوجيميتسو وآخرون ، 2008). يُعتقد أن تثبيط انقسام الخلية ناتج عن تنظيم نقاط التفتيش ، لكن الآلية الدقيقة التي يحدث بها ذلك تظل غير معروفة. DnaA AAA + مستشعر II مطلوب Arg-334 بشكل خاص للتحلل المائي ATP-DnaA والتعبير عن بروتين متحور DnaA R334A يسبب الإفراط في التنشيط وتثبيط نمو الخلية في oriC- بطريقة مستقلة (الجدول 1) (نيشيدا وآخرون ، 2002).

الآلية الأساسية لـ RIDA. عندما يكمل holoenzyme DNA polymerase III تخليق جزء Okazaki على الخيط المتأخر ، يتم تحرير الوحدة الفرعية المشبكية من لب DNA polymerase III وتبقى على الحمض النووي المركب. يرتبط ADP-Hda بالجيب الكارهة للماء للشكل المحمّل بالحمض النووي للمشابك عبر أشكال ربط المشبك في الطرف الأميني لـ Hda. يتفاعل مركب ADP-Hda-clamp-DNA الناتج مع التحلل المائي ATP المرتبط بـ DnaA ويعززه ، مما يؤدي إلى إطلاق ADP-DnaA مرة أخرى في دورة DnaA. يعد التفاعل بين مجالات AAA + في Hda و DnaA أمرًا بالغ الأهمية ، ويساعده التفاعل بين مجال Hda و DnaA IV (مجال ربط الحمض النووي). N ، Hda-amino terminus I-II ، DnaA domain I-II III ، DnaA domain III (AAA + domain) IV ، DnaA domain IV (مجال ربط الحمض النووي).

يتكون بروتين Hda من منطقة نهاية أمينية قصيرة تحتوي على شكل ربط المشبك ومجال AAA + الذي يتماثل مع مجال DnaA III (الشكل 4) (Dalrymple et al. 2001 Kato and Katayama 2001 Kurz et al. 2004 Su ' etsugu وآخرون 2005 Xu وآخرون 2009). يوجد نموذج ربط المشبك Hda بشكل شائع في بروتينات ربط المشبك مثل الوحدة الفرعية الأساسية لـ DNA polymerase III α (Dalrymple et al. 2001). إنه يرتبط بالجيب الكاره للماء من المشبك ، وهو نفس الموقع الذي يرتبط به DNA polymerase III subunit α (Dalrymple et al. 2001 Kurz et al. 2004 Su’etsugu et al. 2005). يربط نطاق Hda AAA + ADP على وجه التحديد ، ولكن ليس ATP (Su’etsugu et al. 2008). ADP-Hda أحادي ونشط في RIDA ، في حين أن apo-Hda متعدد العلامات وغير نشط في RIDA (Su’etsugu et al. 2008). يحمل مجال Hda AAA + بقايا Arg محددة (أي Arg finger) وهو أمر بالغ الأهمية لتعزيز التحلل المائي DnaA-ATP (Su’etsugu et al. 2005). قد تشارك هذه البقايا في تكوين مركز تحفيز التحلل المائي ATP عن طريق تفاعل DnaA-Hda المباشر. هذه خاصية شائعة للعديد من بروتينات AAA + (Neuwald et al. 1999 Ogura et al. 2004 Indiani and O’Donnell 2006). بالإضافة إلى Arg finger ، هناك بقايا محددة داخل مجالات AAA + من DnaA و Hda مطلوبة لتفاعل DnaA-Hda والتحلل المائي DnaA-ATP (ناكامورا وآخرون 2010). يعزز مجال DnaA IV (مجال ربط الحمض النووي) هذا التفاعل من خلال الارتباط بـ Hda (الشكل 4) (Keyamura و Katayama 2011).

أثناء استطالة الحمض النووي ، تظل المشابك على الشريط المتأخر بعد تصنيع شظايا Okazaki ويتم تحرير نواة DNA polymerase III (Yuzhakov et al. 1996 Balakrishnan and Bambara 2013 Goodman and Woodgate 2013 Hedglin et al. 2013 MacAlpine and Almouzni 2013). تربط مشابك الحمض النووي الخالية من بوليميريز الحمض النووي ADP-Hda ، مما يؤدي إلى تنشيط RIDA (Su’etsugu et al. 2004 ، 2008). بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن أنه نظرًا لأن المشبك عبارة عن وحدة homodimer ، فإن الوحدة الفرعية Hda و DNA polymerase III α ترتبط بكل بروتومر من نفس المشبك للسماح لـ Hda بالتحلل المائي لـ DnaA-ATP بمجرد بدء شوكات النسخ المتماثل (Johnsen et al. 2011). المشابك الخالية من الحمض النووي غير نشطة في RIDA ، على الرغم من أنها يمكن أن تربط Hda ، مما يضمن تنشيط RIDA في الوقت المناسب والنسخ المتماثل. منطقة dsDNA التي تحيط بالمشبك مطلوبة لـ RIDA ، ويمكن التعرف عليها بواسطة DnaA (الشكل 4) (Su’etsugu et al. 2004).

مركب ADP-Hda-clamp-DNA مستقر ، في حين أن تقارب هذا المركب لـ DnaA ضعيف (Su’etsugu et al. 2008). يتوافق هذا مع حقيقة أن المركب يُعاد استخدامه للتفاعل الدوري مع جزيئات ATP-DnaA المتعددة ، وأن هناك حوالي 100 جزيء Hda فقط لكل خلية (Katayama et al. 2010).

المبدأ الرئيسي لـ RIDA ، وهو استخدام المشابك المحملة بالحمض النووي للحصول على ردود فعل سلبية مقترنة بالنسخ المتماثل للبروتين البادئ ، يتم الحفاظ عليه تطوريًا من البكتيريا إلى حقيقيات النوى ، بما في ذلك الخميرة ، Xenopusوالخلايا البشرية (الجدول 1) (Katayama et al. 2010 Zielke et al. 2012).


طالب جنوب شرق يستكشف استنساخ E. Coli DNA في أبحاث NSF الصيفية

تعرف Adrienne Brauer كل شيء عن الاستعداد والإيقاع والإيقاع والسرعة كعداء لمسافات طويلة في اختراق الضاحية وتتبع الفرق في جامعة جنوب شرق ولاية ميسوري.

على الرغم من ذلك ، قامت هذا الصيف بإعادة توظيف تلك المهارات خارج الدورة التدريبية في الخبرات البحثية لمؤسسة العلوم الوطنية (NSF) للطلاب الجامعيين (REU) في جامعة واشنطن في سانت لويس حيث تعمل مع الدكتورة بيترا ليفين ، أستاذة الأحياء والمديرة المشاركة لـ برنامج الدراسات العليا في العلوم الحيوية النباتية والميكروبية ، ووضع الساعات ، والتحضير لمدرسة الدراسات العليا واكتساب الخبرة لمهنة تتمحور حول أبحاث علم الأحياء الدقيقة.

Adrienne ، من أوكفورد ، إلينوي ، يعرف أن النجاح يأتي مع التدريب ، ووضع الأساس ، والتكييف ، وتخطي العقبات والخطوة إلى خط النهاية. Adrienne هو متقدم في الجنوب الشرقي ، وهو متخصص في علم الأحياء الدقيقة مع تخصص ثانوي في الكيمياء. تأمل أن تساعد تجربتها في جامعة واشنطن في إعدادها لخطوتها التالية في رحلتها التعليمية.

تقول Adrienne إنها تجري بحثها هذا الصيف جنبًا إلى جنب مع طلاب ما بعد الدكتوراه وطلاب جامعيين آخرين ، للاختبار الإشريكية القولونية القدرة على أن تصبح أكثر مقاومة للمضادات الحيوية تحت الضغط. تقول إنها تدرس كيف بكتريا قولونية تكرار الحمض النووي الخاص بهم أثناء النمو السريع. وقالت إنه عندما تنمو الخلية بسرعة كبيرة بحيث يتعذر على تكاثر الحمض النووي مواكبة ذلك ، فإنها تخضع لتكرار متعدد الشوكات ، ويحدث هذا عندما يبدأ الحمض النووي للخلية في جولة ثانية (أو ثالثة أو رابعة) من التكاثر قبل اكتمال الجولة الأولى.

قال أدريان: "نستخدم البروتينات الفلورية لتسمية مواقع معينة على الكروموسوم ، وعندما تنظر إلى هذه الخلايا تحت المجهر ، ترى الأصل والنهاية يتوهجان باللونين الأحمر والأخضر اللامعين". "لقد كان استخدام التصوير الفلوريسنت تجربة رائعة بالنسبة لي هنا. يتميز المجهر الذي نستخدمه بتقنية عالية جدًا ويسمح لنا أيضًا بعمل "أفلام" للخلايا تنمو وتتحرك على مدار ساعات ".

في وقت لاحق من الصيف ، تخطط لاستنساخ حفنة من الجينات في السلالات التي كانت تعمل معها ومراقبة التأثير على تكاثر الحمض النووي.

قالت: "لقد كان الوقت الذي قضيته في المختبر مجزيًا ومثمرًا بشكل خاص بفضل عامين من البحث الذي أمضيته في مختبر الدكتور (جيريمي) Ellermeier في جنوب شرق". "لقد علمني الكثير مما كان له دور في مختبر الدكتور ليفين!"

يحضر Adrienne أيضًا الندوات والدروس البحثية في جامعة واشنطن لتعلم مهارات مفيدة لمدرسة الدراسات العليا ، مثل "خصوصيات وعموم الباحثين الجيدين" ، والاعتبارات الأخلاقية ، والتواصل مع الجماهير ، وكتابة اقتراح منحة وهمية ، وإجراء مراجعة للأدبيات والمشاركة في عرض ملصق لأبحاثها في ختام البرنامج.

قالت: "الجميع متعاونون ، وكفريق ، علموني الكثير بالفعل". "لقد تذوقت طعم المستقبل الذي سيكون عليه مستقبلي كطالب متخرج. أنا & # 8217m في المختبر وحضور ورش العمل والفصول الدراسية لمدة تصل إلى تسع ساعات في اليوم ، والتعرف على المهن في العلوم البيولوجية ، والطرق الجديدة لتحليل الخلايا البكتيرية وكيف أصبح باحثًا أكثر استقلالية يصنع فرضيات خاصة بي. "

خارج المختبر ، كان Adrienne والمتدربون الآخرون الجامعيين يحضرون الفصول الدراسية وورش العمل لتحسين مهاراتهم البحثية وإعدادهم للدراسات العليا.

Adrienne Brauer ، في الوسط ، هي عضوة في فريق سباقات المضمار والميدان في جنوب شرق النساء & # 8217s الذي احتل المركز الثاني في بطولة مضمار السباق والميدان في أوهايو فالي التي أقيمت مؤخرًا في الجنوب الشرقي في مايو.

"نلتقي ونتحدث مع محترفين من شركات التكنولوجيا الحيوية مثل Pfizer و Bayer ونعقد اجتماعات استشارية فردية مع أعضاء هيئة التدريس الذين يساعدوننا في توجيهنا في الاتجاه الصحيح ، سواء كان ذلك لمتابعة الدكتوراه أو كلية الطب أو MTSP (الطب وقالت "تدريب العلماء)". "بحلول نهاية الصيف ، سأشعر بالثقة في التقدم إلى بعض من أفضل برامج علم الأحياء الدقيقة في البلاد."

قامت Adrienne وزملاؤها المتدربون أيضًا باستكشاف سانت لويس وقضوا وقتًا طويلاً في قاعة إقامة Danforth ، حيث استضافوا نوادي المجلات غير الرسمية في المساء لمناقشة أفضل الطرق لمراقبة توطين الركيزة في البكتيريا ، على حد قولها. لقد أمضوا أيضًا ليالي اللعب ، ولأنها تعيش بالقرب من فورست بارك ، فإنها تجري أيضًا في المتنزه كل يوم تقريبًا.

تقول إنها تقدر فرصة العمل مع كل من الطلاب الموهوبين وأعضاء هيئة التدريس في NSF REU هذا الصيف.

قالت: "أنا محاط بمهنيين رائعين في المجال الذي أريد العمل فيه". "لا أقوم فقط بإطعام فضولي في علم الأحياء الدقيقة ولكني أكسب المهارات والمعرفة اللازمة لدخول مدرسة تخرج رائعة. أنا & # 8217m أخطط للحصول على درجة الدكتوراه. في علم الأحياء الدقيقة ، والمدارس التي تقدم أفضل البرامج تنافسية للغاية. سيساعدني هذا REU بشكل كبير. & # 8221

إنها ليست متأكدة تمامًا من الشكل الذي ستبدو عليه حياتها المهنية في المستقبل ، لكنها ستشمل بالتأكيد البحث.

"بقدر ما استمتعتُ بالعمل مع السالمونيلا في SEMO ، لا يمكنني الانتظار حتى أتفرع وأعمل مع بكتيريا أخرى. أود أن أعمل في المعاهد الوطنية للصحة أو مركز السيطرة على الأمراض ، لكنني سأستمتع أيضًا بالتدريس في جامعة بها مختبر أبحاث ".

تقول Adrienne إن مدرسي العلوم في المدرسة الثانوية أثاروا اهتمامها بالعلوم في وقت مبكر ووضعوها على مسار في العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (STEM).

قالت: "لقد تحدوني في الفصل وجعلوني أحب الأسئلة العلمية التي تجعلك تفكر حقًا ، والتي كانت أكثر إثارة بالنسبة لي من مجرد حفظ تعريفات المفردات". قالت: "إن" لحظة آها "التي أحصل عليها في دراسة علم الأحياء مجزية للغاية وتجعلني أعود للمزيد". "إن فهم الآليات المعقدة التي تعمل بها الخلايا أمر مثير حقًا واكتشاف آليات لم تكن معروفة من قبل هو الهدف الذي نسعى إليه بعد ذلك."


النسخ المتماثل في بدائيات النوى

يبدأ النسخ المتماثل عند نقطة بدء محددة تسمى نقطة التوجه أو النسخ المتماثل. (Replicon: هي وحدة من الجينوم يتم فيها نسخ الحمض النووي ، وتحتوي على أصل لبدء النسخ المتماثل) وهي نقطة فتح الحمض النووي وتشكيل مجمع مفتوح يؤدي إلى تكوين مجمع ما قبل التقديم لبدء عملية النسخ المتماثل.

يقع موقع OriC في 74 & # 8243 دقيقة بالقرب من جين ilv. يتكون موقع OriC من 245 زوجًا أساسيًا ، منها ثلاثة من أصل 13 تسلسلًا أساسيًا محفوظة بشكل كبير في العديد من البكتيريا وتشكل متواليات الإجماع (GATCTNTTNTTTT). بالقرب من موقع OriC ، هناك أربعة من 9 تسلسلات أساسية لكل منها (TTATCCACA).

تسلسل التفاعلات في عملية البدء كما يلي:

أ) يتعرف بروتين Dna A ويربط ما يصل إلى أربعة مكررات 9bp في OriC لتشكيل مركب من OriC DNA فائق الالتفاف سالبًا ملفوفًا حول قلب مركزي لمونومرات بروتين Dna A. تتطلب هذه العملية وجود الهيستون مثل بروتينات HU أو 1 HC لتسهيل ثني الحمض النووي.

ب) الوحدات الفرعية للبروتين Dna A ثم تذوب على التوالي ثلاث مقاطع متكررة بمقدار 13 نقطة أساس في وجود ATP عند & gt = 22 * ​​C (معقد مفتوح).

ج) يوجه بروتين Dna A مركب Dna B & # 8211 Dna C إلى المنطقة الذائبة لتشكيل ما يسمى بمركب التقديم. تم إصدار الحمض النووي C لاحقًا. يقوم الحمض النووي B بمزيد من الاسترخاء في المجمع المفتوح لتشكيل مجمع ما قبل التقديم.

د) يرتبط DNA gyrase وبروتين الربط المفرد الذي تقطعت به السبل (SSB) وبروتين Rep و Helicase & # 8211 II بمركب التجهيز المسبق والآن يسمى المركب المركب التمهيدي.

ه) في وجود gyrase و SSB ، تقوم الهليكازات بفك الحمض النووي في كلا الاتجاهين للسماح بدخول بريماز وبوليميراز الحمض النووي الريبي. ثم يشكل بوليميراز الحمض النووي الريبي مادة أولية لتوليف حبلا قياديًا بينما يكون بريماز في شكل أساس تخليق بدائي لتخليق الخيوط المتأخرة.

و) بالنسبة للمركب أعلاه ، فإن بوليميراز DNA & # 8211 III سوف يرتبط ويشكل إعادة تشكيل.

رد: إنها البنية متعددة البروتينات التي تتجمع في شوكة التكاثر البكتيري لإجراء تخليق الحمض النووي. يحتوي على بوليميراز DNA وأنزيمات أخرى.

الآن تم إعداد المرحلة لبدء التوليف والاستطالة للمضي قدمًا. ولكن هذا يحدث في مسارين مختلفين ميكانيكيًا في حبلا القالب 5 & # 8242 & # 8211 & gt3 & # 8242 و 3 & # 8242 & # 8211 & gt5 & # 8242 strand.

أ) بدء التوليف والاستطالة على القالب 5 & # 8242 & # 8211 & gt3 & # 8242 (توليف حبلا رائد) (إذا تحركت شوكة النسخ المتماثل في اتجاه 3 & # 8242 & # 8211 & GT5 & # 8242)

يُطلق على حبلا ابنة الحمض النووي التي يتم تصنيعها بشكل مستمر في قالب 5 & # 8242 & # 8211 & gt3 & # 8242 اسم حبلا رائد. يقوم DNA pol-III بتجميع الحمض النووي عن طريق إضافة 5 & # 8242-P من deoxynucleotide إلى مجموعة 3 & # 8242-OH للجزء المقدم بالفعل. وهكذا تنمو السلسلة في اتجاه 5 & # 8242 & # 8211 & GT3 & # 8242. التفاعل المحفز بواسطة DNA pol-III سريع جدًا. يكون الإنزيم أكثر نشاطًا من DNA pol & # 8211 I ويمكنه إضافة 9000 نيوكليوتيد في الدقيقة عند 37 * درجة مئوية. يتحلل أساس RNA الذي تمت إضافته في البداية بواسطة RNA polymerase بواسطة RNase.

ب) بدء التوليف والاستطالة في قالب 3 & # 8242 & # 8211 & gt5 & # 8242 عندما تتحرك الشوكة في اتجاه 3 & # 8242 & # 8211 & gt5 & # 8242 (توليف حبلا متخلفًا)

The daughter DNA strand which is synthesized in discontinuous complex fashion on the 3′–>5′ template is called lagging strand. It occurs in the following steps:

i) Synthesis of Okazaki fragment:

To the RNA primer synthesized by primosome, 1000-2000 nucleotides are added by DNA pol-III to synthesis Okazaki fragments.

ii) Excision of RNA primer:

When the Okazaki fragment synthesis was completed up to RNA primer, then RNA primer was removed by DNA pol – I using its 5′–>3′ exonuclease activity.

iii) Filling the gap (Nick translation)

The gap created by the removal of primer, is filled up by DNA pol – I using the 3′-OH of nearby Okazaki fragment by its polymerizing activity.

iv) Joining of Okazaki fragment: (Nick sealing)

Finally, the nick existing between the fragments are sealed by DNA ligase which catalyze the formation of phosphodiester bond between a 3′-OH at the end of one strand and a 5′ – phosphate at the other end of another fragment. The enzyme requires NAD for during this reaction.

III) TERMINATION:

Termination occurs when the two replicating forks meet each other on the opposite side of circular E.Coli DNA. Termination sites like A, B, C, D, E and F are found to present in DNA. Of these sites, Ter A terminates the counter clockwise moving fork while ter C terminates the clockwise moving forks. The other sites are backup sites. Termination at these sites are possible because, at these sites tus protein (Termination utilizing substance) will bound to Dna B protein and inhibits its helicase activity. And Dna B protein released and termination result.

After the complete synthesis, two duplex DNA are found to be catenated (knotted). This catenation removed by the action of topoisomerase. Finally, from single parental duplex DNA, two progeny duplex DNA synthesized.

REGULATION OF PROKARYOTIC REPLICATION:

Especially initiation of replication is regulated. Dna A protein when available in high concentration then ratio of DNA to cell mass is quiet high but at low Dna A concentration, the ratio found to be low. This shows that Dna A protein regulates the initiation of replication.


DNA Replication, Repair, and Mutagenesis

Polymerase III

Polymerase I plays an essential role in the replication process in بكتريا قولونية، but it is not responsible for the overall polymerization of the replicating strands. The enzyme that accomplishes this is a less abundant enzyme, polymerase III (pol III). (A DNA polymerase II has also been isolated from بكتريا قولونية، but it probably plays no role in DNA synthesis.) Pol III catalyzes the same polymerization reaction as pot I but has certain distinguishing features. It is a very complex enzyme and is associated with eight other proteins to form the pol III holoenzyme. (The term هولونزيم refers to an enzyme that contains several different subunits and retains some activity even when one or more subunits is missing.) Pol III is similar to pol I in that it has a requirement for a template and a primer but its substrate specificity is much more limited. For a template pol III cannot act at a nick nor can it unwind a helix and carry out strand displacement. The latter deficiency means that an auxiliary system is needed to unwind the helix ahead of a replication fork. Pol III, like pol I, possesses a 3′ → 5′ exonuclease activity, which performs the major editing function in DNA replication. Polymerase III also has a 3′exonuclease activity, but this activity does not seem to play a role in replication.

Pol I and pol III holoenzyme are both essential for بكتريا قولونية تكرار. The need for two polymerases seems to be characteristic of all cellular organisms but not all viruses, e.g., بكتريا قولونية. Phage T4 synthesizes its own DNA polymerase, which is capable of carrying out all functions necessary for synthesizing phage DNA.

In the usual polymerization reaction, the activation energy for phosphodiester bond formation comes from cleaving of the triphosphate. Since DNA ligase can use a monophosphate, another source of energy is needed. This energy is obtained by hydrolyzing either ATP or NAD the energy source depends on the organism from which the DNA ligase is obtained.

Ligases have two major functions: the sealing of single-strand breaks produced randomly in DNA molecules by nucleases and the joining of fragments during a particular stage of replication. DNA ligases are enzymes that can form a phosphodiester bond at a single-strand break in DNA, a reaction between a 3′-OH group and a 5′-monophosphate. These groups must be termini of adjacent base-paired deoxynucleotides ( Figure 24-4 ).

Bacteria usually contain a single species of ligase. Mammalian cells possess two DNA ligases (I and II) present in very small amounts compared with bacteria. Both eukaryotic ligases are located in the nucleus. Ligase I is predominant in proliferating cells and presumably plays a role in DNA replication ligase II predominates in resting cells.


Sandwalk

I've started reading microcosm by my favorite science writer, Carl Zimmer [Buy This Book!]. Watch for a review, coming soon.

I was mildly disappointed to see Carl repeat a common myth about DNA replication in بكتريا قولونية on page 29. Since we often use this myth to teach critical thinking in our undergraduate classes, I thought it would be worthwhile to discuss it here.

Today I'm going to present the problem and let everyone think about a possible solution. On Sunday, I'll publish the answer. (If you know the solution, you are not allowed to post it in the comments&mdashI'll delete those comments. You can ask for clarification or speculate.)

Here's what Carl says at the top of page 29.

Today, we're not concerned about the 20 minute generation time but I note, for the record, that the average generation time of بكتريا قولونية, في الجسم الحي, is about one day. I also want to mention that the 20 minute generation time is an extreme example that's achieved only under the most extraordinary circumstances. Typical generation times in the lab are about 30 minutes.

However, that's not the problem. Let's assume a generation time of 20 minutes.

In the next paragraph Carl says .

What Carl is referring to the the assembly of replication complexes (replisomes) at the origin of replication. Once those complexes are assembled, replication fires off and proceeds in opposite directions (bidirectionally) until the two fork meet at the opposite side of the chromosome.

Carl is correct when he says that the forks move at 1000 nucleotides per second. Later on in his book he mentions that the size of the بكتريا قولونية chromosome is 4,600,000 base pairs or 4,600 kb (p. 116). At 1000 nucs per second it would take 4600 second to replicate this DNA if there was only one replication fork. Since there are two, it will take 2,300 seconds.

You can do the math. This is 38 minutes. It is a correct number&mdashit takes at least 38 minutes to replicate the بكتريا قولونية chromosome, not 20 minutes as stated earlier. It is true that the generation time of بكتريا قولونية can be as short as 20 minutes under extraordinary circumstances.

Here's the problem. كيف يمكن بكتريا قولونية divide faster than it can replicate it's chromosome?


Because Science!

Good morning, everyone! It hasn’t been very long since you heard from me last, but I hope you all had a good night! Although I don’t normally get up at this hour on Thursdays, I have a test to study for, so I’m here to bring you the wonders of DNA replication. Today’s subject: prokaryotes!

We know that, when one cell splits into two, it has to copy its DNA so that each of the daughter cells will have a copy. We also know that the mechanism for this is a pretty straightforward one: the strands of the double helix are pulled apart, and each strand is used as a template to make its complementary strand. (This is called semiconservative, since each daughter copy has one old strand and one new one.)

High school biology students are also probably aware that DNA replication occurs at origins of replication, and replication forks move away from origins at both directions. في بكتريا قولونية، the origin is OriC.

As mentioned in my post on transcription, unwinding the double helix creates tension (positive supercoiling) that can stop replication if it’s not alleviated. Thus, an enzyme called DNA gyrase (a type II topoisomerase) uses ATP to introduce negative supercoiling.

Other proteins are also important to the process of replication: helicase, an ATP-dependent enzyme, binds to a single-stranded region of DNA and then unwinds the rest of it by disrupting the hydrogen bonds between base pairs. SSBs, or single-stranded binding proteins, keep the single strands from reannealing before our polymerase can do its magic.

And, speaking of the polymerase, let’s introduce our main player! The main part of replication is carried out by an enzyme (or, I guess, a class of enzymes) called DNA polymerase. These use the single-stranded template of DNA to synthesize a complementary strand by assembling dNTPs in the proper order.

However, there’s a problem with this enzyme: it can only add nucleotides in a 5′ to 3′ direction. That’s no problem for the 3′-5′ strand, whose complementary strand (the “leading” strand) runs in that direction, but a little bit of a problem arises when dealing with the opposite template. In fact, the best our DNA polymerases can do is bend the 5′-3′ strand around and replicate it in small (1000-2000 bp) backwards. This leads to the creation of fragments called Okazaki fragments, which are then sealed together in the final product to form a whole “lagging” strand.

Another limitation of DNA polymerases is that they can’t start synthesizing a complementary strand from scratch. This is easily alleviated, though, by an enzyme called primase, an enzyme that synthesizes short stretches of RNA called “primers.” Primers give the DNA polymerase a starting point, and they’re replaced with DNA in the final product.

Now, you’re noticing that I’m referring to polymerases in the plural, implying that we don’t have just one. That’s true for both prokaryotes and eukaryotes (unlike RNA polymerase, which is the only prokaryotic RNA polymerase). To keep things a little ([coughs up a lung] A LOT) simpler, we’re going to start by looking at just prokaryotic replication, and there’s no better place to start than the polymerases.

Prokaryotes have five DNA polymerases that are designated with numerals I through V. I, II and V mostly just deal with DNA repair, so we won’t talk about them too much. Wikipedia describes IV as “an error-prone polymerase involved in non-targeted mutagenesis.” III is the one that carries out most DNA replication it’s not very abundant in cells, but it’s extremely processive (good at hanging on to the DNA template) in comparison to the others.

DNA polymerase III holoenzyme is composed of seventeen different subunits, each of which confers it some sort of functionality. The most noteworthy of these is the gamma-complex, which acts as a “clamp loader” by helping clamp the beta-dimer rings of the enzyme (which help keep it on the DNA) to the strand using ATP.

Now, once we actually get our polymerase III going and making DNA, DNA polymerase I gets its time to shine. This enzyme carries out the very important job of replacing the RNA primers with DNA. It’s also special because, in addition to being able to do this, is can remove nucleotides from a DNA strand in على حد سواء the 3′ to 5′ and 5′ to 3′ direction.

The 3′ to 5′ exonuclease activity is useful because it means that this enzyme can quite literally check its work as it goes. If it discovers that it’s made a mistake, all it has to do is back up and chew the incorrect base off of the growing strand. Pretty nifty, if you think about it.

After polymerase I does its thing, an enzyme called يجاز comes in an seals the nicks in the backbone left behind by all of this priming and Okizaki fragment-forming nonsense.

Finally, we need to terminate our DNA replication. In prokaryotes, this isn’t too difficult: it just requires the تير sequence (GTGTGTTGT). Tus protein, a contrahelicase, binds here and basically just goes, “Nope nope nope, no helicase is passing through here!” The replication forks end, and replication is terminated.

See, not too bad, huh? Now we get to the really fun stuff—those stupid, show-off eukaryotes!

See a lot of errors? Feel the need to point them out? Please have mercy—I’m posting this without proofing it, because I’m kinda in a hurry here.


70 DNA Replication in Eukaryotes

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • ناقش أوجه التشابه والاختلاف بين تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى وبدائيات النوى
  • اذكر دور التيلوميراز في تكرار الحمض النووي

تعتبر جينومات حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا وأكبر حجمًا من جينومات بدائية النواة. تحتوي حقيقيات النوى أيضًا على عدد من الكروموسومات الخطية المختلفة. يحتوي الجينوم البشري على 3 مليارات زوج قاعدي لكل مجموعة أحادية الصبغيات من الكروموسومات ، ويتم تكرار 6 مليارات زوج قاعدي خلال المرحلة S من دورة الخلية. هناك أصول متعددة للتكاثر على كل كروموسوم حقيقي النواة يمكن أن يكون لدى البشر ما يصل إلى 100000 أصل من النسخ المتماثل عبر الجينوم. معدل النسخ المتماثل حوالي 100 نيوكليوتيد في الثانية ، أبطأ بكثير من تكرار بدائيات النواة. في الخميرة ، وهي حقيقيات النوى ، توجد تسلسلات خاصة تُعرف باسم تسلسل النسخ الذاتي (ARS) على الكروموسومات. هذه مكافئة لأصل النسخ المتماثل في بكتريا قولونية.

عدد بوليميرات الحمض النووي في حقيقيات النوى أكثر بكثير مما هو عليه في بدائيات النوى: 14 معروفة ، منها خمسة معروفة بأدوار رئيسية أثناء التكاثر وقد تمت دراستها جيدًا. هم معروفون باسم بول α، بول β، بول γ، بول δو بول ε.

الخطوات الأساسية للنسخ هي نفسها كما في بدائيات النوى. قبل أن يبدأ النسخ المتماثل ، يجب توفير الحمض النووي كقالب. يرتبط الحمض النووي حقيقيات النوى بالبروتينات الأساسية المعروفة باسم الهيستونات لتكوين هياكل تسمى النيوكليوسومات. يجب إزالة الهستونات ثم استبدالها أثناء عملية النسخ المتماثل ، مما يساعد على حساب معدل النسخ المنخفض في حقيقيات النوى. قد يخضع الكروماتين (المركب بين الحمض النووي والبروتينات) لبعض التعديلات الكيميائية ، بحيث يمكن للحمض النووي أن ينزلق عن البروتينات أو يكون في متناول إنزيمات آلية تكرار الحمض النووي. في أصل النسخ المتماثل ، يتكون معقد ما قبل النسخ المتماثل ببروتينات بادئ أخرى. Helicase and other proteins are then recruited to start the replication process ((Figure)).

Difference between Prokaryotic and Eukaryotic Replication
ملكية Prokaryotes حقيقيات النواة
Origin of replication غير مرتبطة عديد
Rate of replication 1000 nucleotides/s 50 to 100 nucleotides/s
أنواع بوليميراز الحمض النووي 5 14
تيلوميراز Not present الحالي
إزالة RNA التمهيدي بول أنا RNase H.
استطالة حبلا DNA pol III بول α ، بول ، بول
انزلاق المشبك انزلاق المشبك PCNA

إن الهليكاز الذي يستخدم الطاقة من التحلل المائي ATP يفتح الحلزون DNA. تتشكل شوكات النسخ المتماثل في كل أصل نسخ متماثل مع فك الحمض النووي. يؤدي فتح اللولب المزدوج إلى الالتفاف المفرط ، أو الالتفاف الفائق ، في الحمض النووي قبل شوكة النسخ المتماثل. يتم حلها من خلال عمل الإيزوميراز العلوي. يتم تشكيل الاشعال بواسطة إنزيم بريماز ، وباستخدام التمهيدي ، يمكن لـ DNA pol بدء التوليف. ثم يتم تضمين ثلاثة أنواع رئيسية من بلمرة الحمض النووي: α و و ε. يضيف DNA pol α جزءًا قصيرًا (20 إلى 30 نيوكليوتيد) من الحمض النووي الريبي التمهيدي على كلا الخيوط ، ثم يسلم إلى بوليميراز ثانٍ. بينما يتم تصنيع الخيط الرئيسي بشكل مستمر بواسطة قطب الإنزيم δ، يتم تصنيع الخيط المتأخر بواسطة pol ε. إن بروتين مشبك منزلق يعرف باسم PCNA (مستضد نووي خلوي متكاثر) يحمل بولي DNA في مكانه بحيث لا ينزلق من الحمض النووي. عندما تتدفق pol إلى RNA التمهيدي على الخيط المتأخر ، فإنها تزيحه من قالب الحمض النووي. يتم بعد ذلك إزالة الحمض النووي الريبي التمهيدي بواسطة RNase H (نوكلياز رفرف AKA) واستبداله بنكليوتيدات الحمض النووي. يتم ربط شظايا أوكازاكي في الخيط المتأخر بعد استبدال البادئات RNA بالحمض النووي. يتم سد الفجوات المتبقية بواسطة DNA ligase ، الذي يشكل رابطة phosphodiester.

تكاثر التيلومير

على عكس الكروموسومات بدائية النواة ، فإن الكروموسومات حقيقية النواة خطية. As you’ve learned, the enzyme DNA pol can add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction. في الخيط الرئيسي ، يستمر التوليف حتى الوصول إلى نهاية الكروموسوم. على الخيط المتأخر ، يتم تصنيع الحمض النووي في امتدادات قصيرة ، كل منها يبدأ بواسطة برايمر منفصل. عندما تصل شوكة النسخ إلى نهاية الكروموسوم الخطي ، لا توجد طريقة لاستبدال التمهيدي في نهاية 5 'من الخيط المتأخر. وهكذا يظل الحمض النووي في نهايات الكروموسوم غير متزاوج ، وبمرور الوقت يتم استدعاء هذه النهايات التيلوميرات قد تصبح أقصر تدريجيًا مع استمرار الخلايا في الانقسام.

تتألف التيلوميرات من تسلسلات متكررة لا ترمز لأي جين معين. في البشر ، يتكرر التسلسل المكون من ستة أزواج أساسية ، TTAGGG ، من 100 إلى 1000 مرة في مناطق التيلومير. بطريقة ما ، تحمي هذه التيلوميرات الجينات من الحذف مع استمرار الخلايا في الانقسام. The telomeres are added to the ends of chromosomes by a separate enzyme, telomerase ((Figure)), whose discovery helped in the understanding of how these repetitive chromosome ends are maintained. يحتوي إنزيم التيلوميراز على جزء محفز وقالب مدمج للحمض النووي الريبي. It attaches to the end of the chromosome, and DNA nucleotides complementary to the RNA template are added on the 3′ end of the DNA strand. Once the 3′ end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. وهكذا ، يتم تكرار نهايات الكروموسومات.


ينشط التيلوميراز عادة في الخلايا الجرثومية والخلايا الجذعية البالغة. لا ينشط في الخلايا الجسدية البالغة. For their discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider, and Jack W. Szostak ((Figure)) received the Nobel Prize for Medicine and Physiology in 2009.


التيلوميراز والشيخوخة

تستمر الخلايا التي تخضع للانقسام الخلوي في تقصير التيلوميرات الخاصة بها لأن معظم الخلايا الجسدية لا تصنع التيلوميراز. هذا يعني بشكل أساسي أن تقصير التيلومير مرتبط بالشيخوخة. مع ظهور الطب الحديث والرعاية الصحية الوقائية وأنماط الحياة الصحية ، زاد العمر الافتراضي للإنسان ، وهناك طلب متزايد على الناس ليبدو أصغر سناً وأن يتمتعوا بنوعية حياة أفضل مع تقدمهم في السن.

في عام 2010 ، وجد العلماء أن الإنزيم تيلوميراز يمكنه عكس بعض الحالات المرتبطة بالعمر في الفئران. قد يكون لهذا إمكانات في الطب التجديدي. 1 Telomerase-deficient mice were used in these studies these mice have tissue atrophy, stem cell depletion, organ system failure, and impaired tissue injury responses. تسبب إعادة تنشيط التيلوميراز في هذه الفئران في تمدد التيلوميرات ، وتقليل تلف الحمض النووي ، وتنكس عصبي معكوس ، وتحسين وظيفة الخصيتين والطحال والأمعاء. وبالتالي ، قد يكون لإعادة تنشيط التيلومير إمكانية علاج الأمراض المرتبطة بالشيخوخة لدى البشر.

يتميز السرطان بانقسام الخلايا غير المنضبط للخلايا غير الطبيعية. تتراكم الخلايا الطفرات ، وتتكاثر بشكل لا يمكن السيطرة عليه ، ويمكن أن تهاجر إلى أجزاء مختلفة من الجسم من خلال عملية تسمى ورم خبيث. لاحظ العلماء أن الخلايا السرطانية قد قامت بتقصير التيلوميرات بشكل كبير وأن الإنزيم تيلوميراز نشط في هذه الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أنه فقط بعد تقصير التيلوميرات في الخلايا السرطانية ، أصبح الإنزيم تيلوميراز نشطًا. إذا كان من الممكن إعاقة عمل التيلوميراز في هذه الخلايا عن طريق الأدوية أثناء علاج السرطان ، فمن المحتمل أن يتم إيقاف الخلايا السرطانية من الانقسام الإضافي.

ملخص القسم

Replication in eukaryotes starts at multiple origins of replication. The mechanism is quite similar to that in prokaryotes. A primer is required to initiate synthesis, which is then extended by DNA polymerase as it adds nucleotides one by one to the growing chain. The leading strand is synthesized continuously, whereas the lagging strand is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. The RNA primers are replaced with DNA nucleotides the DNA Okazaki fragments are linked into one continuous strand by DNA ligase. The ends of the chromosomes pose a problem as the primer RNA at the 5’ ends of the DNA cannot be replaced with DNA, and the chromosome is progressively shortened. Telomerase, an enzyme with an inbuilt RNA template, extends the ends by copying the RNA template and extending one strand of the chromosome. DNA polymerase can then fill in the complementary DNA strand using the regular replication enzymes. In this way, the ends of the chromosomes are protected.



تعليقات:

  1. Shaktigore

    أعتذر عن التدخل ، لكني بحاجة إلى مزيد من المعلومات.

  2. Manzo

    الرسالة الواضحة

  3. Jaykell

    كرسالة لطيفة

  4. Brecken

    انت مخطئ. أدخل سنناقشها. اكتب لي في PM.

  5. Gular

    أود الاستمرار ... اشتركت في القناة :)

  6. Ede

    إذا كانت نتائج جيدة



اكتب رسالة