معلومة

البلازميد في النواة والتعبير الجيني

البلازميد في النواة والتعبير الجيني


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا قمنا بإدخال بلازميد في أ نواة بشرية الذي يحتوي على نسخة طبق الأصل من الجين وجميع المروجين ذات الصلة لإنتاج بعض البروتينات البشرية، هل ستخلق الخلية بروتينًا وظيفيًا من هذا البلازميد فقط متى تحتاجها الخلية؟

أنا لا أتحدث عن إدخال الحمض النووي في بعض الكروموسوم. إدخال بلازميد منفصل إلى النواة (تعداء عابر).


إذا قمت بنقل الخلايا بالبلازميد ، فستحتاج هذه البلازميدات إلى الدخول إلى النواة (وإلا فلن يتم نسخها). يحدث الحصول على البلازميد إما أثناء انقسام الخلية (عندما تكون النواة غير موجودة) أو عن طريق إضافة تسلسل إشارة إلى البلازميد الذي يحفز الاستيراد إلى النواة من خلال المسام النووية. تسلسل SV40 هو مثال على هذا التسلسل.

إذا كان لديك المروج الصحيح الموجود على البلازميد ، فيمكنك بشكل أساسي التعبير عن أي بروتين في الخلية (ما لم يكن سامًا). يجب أن يأتي المروج إما من الكائن الحي الذي تكون الخلايا منه أو يجب أن يكون شيئًا منشطًا عالميًا مثل محفز الفيروس المضخم للخلايا (من الفيروس المضخم للخلايا).

وخير مثال على ذلك هو التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي ينشأ من قنديل البحر ويمكن التعبير عنه في الخلايا لجعلها تتوهج باللون الأخضر (من هنا):

الخلايا غير المنقولة أو الخلايا المنقولة ببلازميد فارغ (بدون GFP) لا تتوهج.

من الممكن استهداف خلايا معينة أو التحكم في التنشيط المحدد للجينات في نوع خلية واحد فقط. لكليهما تحتاج إلى تسلسل محفز متسلسل (خاص بالخلية) والذي إما يسمح بالاستيراد النووي (انظر المرجع 1-3) أو التعبير من مروج محدد لنوع الخلية (انظر المرجع 4).

تم إجراء ذلك في كبد الفئران حيث تم القضاء على ApoE. أدى التعبير عن جين ApoE البشري بمحفز معين إلى تصحيح فرط كوليسترول الدم الذي تعاني منه الفئران. هذا يحتاج إلى الكثير من المعرفة حول المحفز وكذلك عن عناصر تنظيم النسخ الأخرى في الجين المحدد (انظر المرجع 4).

مراجع:

  1. استيراد نووي خاص بالخلية من DNA البلازميد.
  2. الدخول النووي الخاص بالأنسجة وعامل النسخ بوساطة الحمض النووي.
  3. التقدم والآفاق: الاستيراد النووي للنواقل غير الفيروسية.
  4. التعبير المستدام عن التحوير الخاص بالكبد من محفز الألبومين في الفئران بعد توصيل الحمض النووي للبلازميد الهيدروديناميكي.

التقدم والآفاق: تصميم وإنتاج نواقل البلازميد

نواقل التعبير DNA البلازميد (pDNA) أساسية لجميع أشكال نقل الجينات غير الفيروسي. في هذه المراجعة ، نناقش مبادئ تصميم وإنتاج pDNA بما في ذلك تأثير المتواليات المشتقة من البكتيريا على التعبير الجيني ومقاربات الدوائر الصغيرة لتقليل آثارها. تم وصف تأثير تضمين عناصر الحمض النووي مثل مناطق ربط مصفوفة السقالة (S / MARs) ، ومواقع ربط عامل النسخ (TF) والمروجين الخاصين بالأنسجة. يتم أيضًا النظر في فوائد التخلص من CG ثنائي النوكليوتيدات (CpGs) من pDNA.


مقدمة

اكتشاف التكرارات المتناظرة القصيرة المنتظمة المتباعدة بانتظام (CRISPR) (Ishino et & # x000a0al.، 1987 Mojica et & # x000a0al.، 1993 van Soolingen et & # x000a0al.، 1993) ، وظيفتها كجزء من نظام المناعة بدائية النواة التكيفية (CRISPR) - النظام المرتبط ، Cas) (Bolotin et & # x000a0al.، 2005 Mojica et & # x000a0al.، 2005 Pourcel et & # x000a0al.، 2005 van der Oost et & # x000a0al.، 2009) ، والتطوير اللاحق إلى أداة تحرير جينومية (Jinek et & # x000a0al. ، 2012 Cho et & # x000a0al.، 2013 Cong et & # x000a0al.، 2013 Mali et & # x000a0al.، 2013) ، أحدث ثورة في مجال البيولوجيا الجزيئية. يركز الكثير من هذا الحماس على الإمكانات السريرية لـ CRISPR / Cas9 لعلاج الأمراض البشرية وتحرير الجينوم البشري. ومع ذلك ، فإن البساطة والخصوصية التي يمكن بها لـ CRISPR / Cas9 تحرير الحمض النووي يغيران وتيرة البحث البيولوجي في العديد من المجالات ، بما في ذلك تحديد وفهم آليات الأمراض الوراثية (Findlay et & # x000a0al.، 2014 Gilbert et & # x000a0al.، 2014 Zhou et & # x000a0al.، 2014 Konermann et & # x000a0al.، 2015) ، التحقق من صحة أهداف المرض (Shalem et & # x000a0al.، 2014 Wang et & # x000a0al.، 2014) ، تطوير نماذج أمراض الحيوان (Wang et & # x000a0al.، 2013 Yang et & # x000a0al.، 2014) . ، 2013) ، وتسهيل الهندسة الوراثية في النباتات (Raitskin & # x00026 Patron، 2016 Zhang et & # x000a0al.، 2016، 2017) ، والسماح بإجراء دراسات جينية أكثر شمولاً (Yao et & # x000a0al.، 2015 Vora et & # x000a0al.، 2016). أدى هذا التأثير الواسع لأداة تحرير الجينات CRISPR / Cas9 إلى إصدار أكثر من 6000 منشور بحثي منذ تطويره قبل خمس سنوات.

قد يستفيد العلاج الجيني بشكل كبير من تقنية CRISPR / Cas9. حتى الآن ، ارتبط أكثر من 3000 جين بالطفرات المسببة للأمراض (Cox et & # x000a0al. ، 2015). الجهود المبكرة لتصحيح الطفرات الجينية المسببة للأمراض في البشر ، على الرغم من نجاحها بشكل عام ، كانت ملطخة بالعديد من المآسي. ربما اشتملت تجربة العلاج الجيني المبكرة الأكثر شهرة على دراستين من فرنسا (Hacein-Bey-Abina et & # x000a0al.، 2002 Hacein-Bey-Abina et & # x000a0al.، 2010) والمملكة المتحدة (Gaspar et & # x000a0al.، 2004) Gaspar et & # x000a0al.، 2011) للأطفال الذين يعانون من نقص المناعة الشديد المرتبط بالكروموسوم X (SCID X-1). من بين 20 براءة اختراع مشاركة في التجربة ، تم علاج 17 براءة اختراع بنجاح وثبات (Cavazzana et & # x000a0al. ، 2016). ومع ذلك ، أصيب خمسة أطفال لاحقًا بسرطان الدم في الخلايا التائية ، مع وفاة طفل واحد من ابيضاض الدم الناتج عن العلاج الكيميائي. في جميع حالات اللوكيميا ، تم إدخال جين تصحيح SCID X-1 في جينوم المريض داخل أو بالقرب من الجينات المعززة للورم وتسبب في تنشيط النسخ (Check ، 2002 Kaiser ، 2003 Thomas et # x000a0al. ، 2003). في مأساة أخرى ، توفي رجل يبلغ من العمر 18 عامًا يعاني من نقص جزئي في ornithine transcarbamylase (OTC) بعد تطوير استجابة التهابية هائلة لمركبة توصيل البضائع الجينية ، وهي ناقل من الفيروسات الغدية ، بعد أربع ساعات من تلقي العلاج (مارشال ، 1999) المؤلفون ، 2002).

من المهم أن نلاحظ أن كلا المأساتين نشأتا عن طريقة التوصيل العلاجية (LaFountaine et & # x000a0al. ، 2015). في حالة SCID X-1 ، لم يتم إدخال بنية الجين المصحح بشكل خاص في الجينوم في حالة OTC الجزئي ، تسبب الناقل الفيروسي في استجابة مناعية شديدة. لذلك من الأهمية بمكان أن تسمح تقنيات العلاج الجيني بتحرير محدد للغاية للجينوم لتقليل مخاطر حدوث الطفرات غير المرغوب فيها ، وأن تسمح وسيلة التوصيل بالنقل الآمن والفعال إلى الهدف.

في غضون عقد واحد فقط بعد هذه المآسي ، تم إحراز تقدم كبير في تطوير تقنيات العلاج الجيني ، مما أدى إلى تجدد الحماس في الوعد بعلاج واسع النطاق للأمراض الوراثية. تشمل التطورات اكتشاف وتطوير نوكليازات خاصة بالموقع لتحرير الجينات: نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) (Bibikova et & # x000a0al. ، 2002) ، نوكليازات المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs) (Christian et & # x000a0al. ، 2010) ، و كريسبر / كاس 9. تشمل التطورات أيضًا أدوات لتسليم الشحنة إلى الخلايا المستهدفة للتحرير الجيني ، على حد سواء خارج الجسم الحي و في الجسم الحي. ستكون هناك حاجة إلى دراسة وتطوير كل من أداة تحرير الجينات وآلية التسليم إذا أريد تحقيق الإمكانات الكاملة لتحرير الجينات العلاجي. ستقدم هذه المراجعة بإيجاز ZFNs و TALENs ، ثم تقدم وصفًا متعمقًا لنظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك التطورات والتعديلات الأخيرة على التكنولوجيا والعوامل التي تؤثر على أداء النظام. سيتبع ذلك ملخص شامل لطرق توصيل CRISPR / Cas9 الحالية ، وإمكانياتها وتحدياتها في تقديم CRISPR ، والمرشحين الواعدين الذين تم الإبلاغ عنهم مؤخرًا لتسليم أنظمة تحرير الجينات.


نتائج

تعديل بروتين TERT الداخلي بعلامة N-terminal FLAG-SNAP

وجدنا أن كفاءة تحرير الجينوم في تيرت كانت المنطقة 5 منخفضة جدًا (انظر أدناه). لذلك قمنا بتصميم بروتوكول من خطوتين لإدخال ترميز التسلسل لعلامة FLAG-SNAP في ملف تيرت موضع (الشكل 1 أ). تم دمج العلامة في الطرف N من TERT لأنه ثبت أن وضع العلامات الطرفية C يضعف قدرة التيلوميراز على إطالة التيلوميرات داخل الخلايا [12].

إدخال تسلسل علامة FLAG-SNAP في الملف الداخلي تيرت المكان. أ تقديم علامة حاتمة FLAG-SNAP N-terminal إلى بروتين TERT الداخلي. أولاً ، تم إنشاء فاصل مزدوج بجوار موقع بدء الترجمة لـ تيرت مع نظام CRISPR-Cas9 (مقص أحمر). الخلايا التي خضعت لإعادة التركيب المتماثل (HR) مع قالب المتبرع (DT) يحتوي على تسلسل العلامات وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز الذي يحركه SV40 (eGFP) تم فحص كاسيت التعبير لإشارة GFP وتم تأكيده بواسطة PCR باستخدام الاشعال أ, ب, ج، و ه، يتم سرد تسلسلها في الجدول S3 في ملف إضافي 1. HA ذراع متماثل TSS موقع بدء النسخ. بعد ذلك ، تمت إزالة كاسيت تعبير eGFP من ملف تيرت من خلال إعادة التركيب بوساطة Cre ، مع ترك التسلسل لعلامات FLAG و SNAP فقط وموقع LoxP المتداخل في نهاية 5 من تيرت تسلسل الترميز. ب شاشة فرز الخلايا (FACS) المنشطة الفلورية لخلايا HEK 293 إيجابية GFP في الخطوة الأولى. البيانات الموضحة مأخوذة من الخلايا المنقولة باستخدام DT الدائري فقط أو DT الدائري + بلازميد Cas9-sgRNA. الخلايا التي تحتوي على إشارة GFP في ملف منطقة مظللة باللون الأخضر تم فرزها. الشكل الداخلي: تم تكبير المنطقة المظللة باللون الأخضر. احتوت مجموعة DT-only على 0.5٪ من الخلايا في هذه المنطقة ، واحتوت مجموعة Cas9-sgRNA + DT على 1.1٪ من الخلايا في هذه المنطقة. ج عينة بيانات شاشة PCR للنسخ التي خضعت لموارد بشرية. يتم تضخيم منتجات PCR بواسطة أزواج البرايمر من أ إلى ب (اللوحة العلوية) و c – e (اللوحة السفلية) ، من الحمض النووي الجيني للخلية المفردة HEK 293 إيجابية GFP والخلايا الأبوية غير المعالجة ، تم تصورها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. العلامة: 1 كيلو بايت سلم DNA (Promega). من بين النسخ الثمانية الموضحة ، ستة نواتج PCR متولدة من الأحجام المتوقعة في كل من PCRs (1402 نقطة أساس للزوج التمهيدي a-b ، 1773 نقطة أساس لزوج التمهيدي c – e). قام Clone 2 بإنشاء منتج PCR الصحيح في a-b PCR. لم ينتج Clone 9 أي منتجات PCR ، كما كان الحال بالنسبة للخلايا الأبوية. د بيانات عينة لفحص PCR للولادة في الحيوانات المستنسخة ، من تجربة تم فيها إدخال تسلسل علامة FLAG وشريط التعبير eGFP في الخلية الذاتية تيرت موضع في خلايا HEK 293T. تم تصوير نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم تضخيمها بواسطة زوج التمهيدي a-e ، من الحمض النووي الجيني للنسخات أحادية الخلية HEK 293T المختارة والخلايا الأبوية غير المعالجة ، بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الحمض النووي الجينومي من الخلايا الأبوية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع 2384 نقطة أساس. الحيوانات المستنسخة التي تحمل الإدخال المستهدف في كليهما تيرت يجب أن تولد الأليلات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل 3652 bp فقط. الحيوانات المستنسخة التي تحمل الإدخال المستهدف في أحد تيرت يجب أن تولد الأليلات نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من كلا الطولين. جميع الحيوانات المستنسخة الثمانية المعروضة كانت متغايرة الزيجوت للإدخال. قد تكون النطاقات الوسطى (المشار إليها بعلامة النجمة) بين نطاقي 3652 و 2384 bp هي مزيج من حبلا واحد من 2384 نيوكليوتيد وخيط نيوكليوتيد 3652 واحد ، لأنه يحتوي على نفس تسلسل النطاق العلوي المقابل للأليل المحرر في بيانات التسلسل الخاصة بنا. تم إجراء نفس التجربة لاحقًا على استنساخ HEK 293 مع إدخال تسلسل علامة FLAG-SNAP وكاسيت تعبير eGFP. يجب أن يكون منتج PCR من الأليل الذي خضع لـ HR 4321 نقطة أساس ، وهو ما فشلنا في الحصول عليه ، على الأرجح بسبب الطول الطويل. ثم اعتبرنا الاستنساخ متغاير الزيجوت إذا ظهر منتج 2384 نقطة أساس. ه شاشة FACS للخلايا السلبية GFP في الخطوة الثانية. بعد تعداء البلازميد كري أو عدم وجود تعداء ، الخلايا ذات إشارة GFP منخفضة (منطقة مظللة باللون الأزرق) تم فرزها. F بيانات عينة لشاشة PCR للنسخ التي تم فيها استئصال كاسيت التعبير eGFP من خلال إعادة تركيب Cre. يتم تضخيم منتجات PCR بواسطة زوج التمهيدي a-d ، من الحمض النووي الجيني للنسخة الأصلية الإيجابية لـ GFP بدون تعبير Cre (كري ) والعديد من الحيوانات المستنسخة سلبية GFP أحادية الخلية بعد إعادة تركيب Cre (كري + ) ، تم تصورها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. العلامة: 1 كيلو بايت سلم DNA (Promega). في خلايا Cre ، يكون حجم منتج PCR هو 3031 نقطة أساس. بعد أن يتم استئصال كاسيت التعبير eGFP عن طريق إعادة تركيب Cre ، ينخفض ​​حجم منتج PCR إلى 1874 نقطة أساس

أولاً ، تم إدخال تسلسل العلامات وشريط التعبير المحسن للبروتين الفلوري الأخضر (eGFP) المحاط بمواقع LoxP على الفور في اتجاه المنبع من موقع بدء الترجمة الذاتية تيرت عن طريق تحويل بلازميد دليل Cas9 أحادي (sgRNA) [13] وبلازميد قالب مانح (DT) إلى خلايا (الشكل 1 أ). تم استخدام علامة التألق المعبر عنها من شريط eGFP لفحص الحيوانات المستنسخة التي خضعت لإعادة التركيب المتماثل (HR). اختبرنا عددًا من تسلسلات sgRNA (الجدول S1 في ملف إضافي 1) في خلايا HEK 293T ، واخترنا استخدام sgRNA الذي يوجه Cas9 للقطع بين الأزواج الأساسية في الموضعين −2 و 1 بالنسبة إلى موقع بدء الترجمة ، لأنه لن يستهدف DT ، وبالتالي يمنع قطع أليل معدل. قارنا البلازميد الدائري مقابل البلازميد الخطي مثل DT (الجدول S2 في ملف إضافي 1) لتحديد ما إذا كان هناك تأثير على كفاءة الاستهداف. كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ GFP في مجموعات Cas9-sgRNA أعلى من تلك الموجودة في مجموعات التحكم المقابلة التي تفتقر إلى Cas9-sgRNA. ومع ذلك ، كانت معدلات الاستهداف في كلتا الحالتين منخفضة (

1٪) ، مما يدل على فائدة علامة التألق. نظرًا لأن تواتر التكامل غير المحدد (النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ GFP في المجموعات التي تفتقر إلى Cas9 – sgRNA) كان أعلى باستخدام DT الخطي ، فقد اخترنا استخدام DT الدائري للتجارب اللاحقة لتقليل التأثيرات غير المستهدفة.

ثم تم استخدام البروتوكول الذي تم التحقق من صحته لتحرير خلايا HEK 293 ، والتي تحمل نسختين من تيرت الجين. لعزل الحيوانات المستنسخة أحادية الخلية ، تم زرع الخلايا الإيجابية لـ GFP التي تم الحصول عليها عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) في 96 طبقًا جيدًا عن طريق الحد من التخفيف. الكفاءة المنخفضة لإدخال eGFP في تيرت يظهر الموضع بسهولة من ملفات تعريف FACS للخلايا المستهدفة (الشكل 1 ب). تم تأكيد الموارد البشرية بواسطة PCR مع أزواج التمهيدي a-b و c-e (الشكل 1 أ ، ج الجدول S3 في الملف الإضافي 1) أدى 27 من 32 نسخة (84٪) إلى ظهور منتجات PCR بالحجم المتوقع (الشكل 1 أ). 1 ج). لتحديد عدد تيرت الأليلات التي خضعت لـ HR ، أجرينا تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام زوج التمهيدي a-e ، مما يدل على أن جميع الحيوانات المستنسخة قد خضعت لمعدل ضربات القلب عند أحد الأليلين (الشكل 1 د). قمنا بتسلسل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للأليلين a – b و c – e و a – e من كلا الأليلين. حمل الأليل الذي خضع لـ HR التسلسل المتوقع ، بينما احتوى الأليل الثاني في جميع الحيوانات المستنسخة على إدخالات صغيرة أو عمليات حذف (indels) حول موقع Cas9 المستهدف. يشير هذا إلى أن كلا الأليلين قد تم قطعهما بواسطة Cas9 ، أحدهما يتم إصلاحه بواسطة HR والآخر يتم إصلاحه عن طريق الانضمام إلى نهاية غير متجانسة (NHEJ) ، مما يؤدي إلى إنتاج indels الصغيرة.

بعد ذلك ، اخترنا نسخة واحدة (استنساخ 3 في الشكل 1 ج) لتنفيذ الخطوة الثانية من البروتوكول. احتوى هذا الاستنساخ على حذف صغير قدره 19 نقطة أساس في الأليل الذي تم إصلاحه بواسطة NHEJ (−1 إلى +18 نسبة إلى موقع بدء الترجمة الأصلي) ، مما أدى إلى إزالة كودون البداية الداخلي ومن المفترض أنه تم التخلص من تعبير بروتين TERT من هذا الأليل. لقد عبرنا بشكل عابر عن بروتين اندماج eGFP-Cre [14] في هذا الاستنساخ لاستئصال شريط eGFP. بعد ثمانية أيام من تعداء العدوى ، قمنا بفحص سكان الخلايا بحثًا عن الخلايا السلبية GFP باستخدام FACS (الشكل 1 هـ). تم إنشاء استنساخ خلية واحدة عن طريق الحد من التخفيف ، وتم استخدام PCR مع زوج التمهيدي a - d (الشكل 1 أ ، الجدول S3 في ملف إضافي 1) لتأكيد استئصال كاسيت تعبير eGFP (الشكل 1f). تم تأكيد جميع الحيوانات المستنسخة الخمسة التي تم اختبارها لاحتوائها على تسلسل علامة FLAG-SNAP المُدرج في نهاية 5 ′ من الطبقة الداخلية. تيرت تسلسل الترميز. تحقق تحليل رقم نسخة الجينات من أن جميع النسخ احتوت على نسختين من تيرت (ملف إضافي 2).

تم تنفيذ نهج بديل باستخدام علامة مقاومة بوروميسين بدلاً من علامة مضان eGFP في بلازميد DT في خلايا هيلا (الشكل S1 في ملف إضافي 1). أولاً ، تم استخدام مجموعة خلايا مختارة من بوروميسين لتوليد استنساخ خلية واحدة. خضعت جميع الحيوانات المستنسخة المعزولة لموارد بشرية (الشكل S1a في ملف إضافي 1). بعد يومين من تعداء عابر للبلازميد eGFP-Cre ، تم زرع استنساخ خلية واحدة من مجموعة الخلايا الإيجابية لـ GFP. خضعت جميع الحيوانات المستنسخة التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة لاستئصال ناجح لعلبة مقاومة البوروميسين (الشكل S1b في ملف إضافي 1). تحقق تسلسل منتجات PCR من الأليلات التي تحمل علامات FLAG-SNAP التي خضعت لموارد HR ، وكشفت عن أليلات غير مميزة تحتوي على indels الصغيرة حول موقع القطع Cas9 (من المفترض عبر NHEJ). نظرًا لأن خلايا هيلا تحمل خمس أو ست نسخ من تيرت الجين [10] ، العدد الدقيق لأليلات HR وأليلات NHEJ غير معروف.

تحليل تعبير ونشاط بروتين FLAG-SNAP-TERT

لتحديد ما إذا كان بروتين الاندماج FLAG-SNAP-TERT قد تم التعبير عنه في خلايا HEK 293 المعدلة ، قمنا بتحليل lysates الخلية بأكملها بواسطة لطخة غربية. اكتشف الجسم المضاد لـ FLAG نطاقًا بالحجم المتوقع في النسخ المحررة ، ولكن ليس في خلايا الأبوين HEK 293 (الشكل 2 أ) ، مما يؤكد التعبير عن بروتين FLAG-SNAP-TERT. وبالمثل ، تم اكتشاف FLAG-SNAP-TERT فقط في نسخ هيلا المُعدلة ولكن ليس في خلايا هيلا الأبوية (الشكل S2a في ملف إضافي 1).

تعبير وتنقية ونشاط بروتين FLAG-SNAP-TERT. أ لطخة غربية من lysates لخلايا HEK 293 الأبوية والنسخ المحررة التي تعبر عن FLAG-SNAP-TERT باستخدام جسم مضاد FLAG. العصابات بالحجم المتوقع لـ FLAG-SNAP-TERT (سهم) يشير إلى أن بروتين الاندماج يتم التعبير عنه في النسخ المعدلة. ب تم الكشف عن FLAG-SNAP-TERT المناعي بجسم مضاد FLAG من خلايا HEK 293 الأبوية والعديد من النسخ المعدلة بواسطة لطخة غربية باستخدام أجسام مضادة ضد علامة FLAG و TERT. تم اكتشاف الإسفار باستخدام صبغة SNAP Surface® 594 المرتبطة تساهميًا بعلامة SNAP. تم استكمال جميع العينات بالتحكم في IP (تحكم IP). ج تم الكشف عن FLAG-SNAP-TERT المناعي بجسم مضاد لـ TERT من خلايا HEK 293 الأبوية والعديد من النسخ المعدلة بواسطة لطخة غربية باستخدام أجسام مضادة ضد علامة FLAG و TERT. لوحظ أيضًا نطاق بحجم TERT الداخلي على البقعة الغربية للنسخ المعدلة ، والتي لا ينبغي أن تنشأ من أليل NHEJ حيث تمت إزالة كودون البداية بواسطة indel. أحد الاحتمالات هو أن كودون البدء الأصلي لـ TERT الداخلي على أليل FLAG-SNAP لا يزال يستخدم إلى حد ما بدلاً من كودون البدء قبل تسلسل علامة FLAG. كشف الأسفار و IP ctrl كما هو الحال في اللوحة (ب). د البقع الغربية والتصوير الفلوري ، مقارنة كفاءة IP لـ FLAG-SNAP-TERT باستخدام مضاد FLAG (F) أو مكافحة TERT (تي) الجسم المضاد. ه فحص نشاط التيلوميراز المباشر للإنزيم تيلوميراز المنقى من خلايا HEK 293 الأبوية والعديد من الحيوانات المستنسخة HEK 293 المعدلة مع الجسم المضاد لـ FLAG أو المضاد لـ TERT. لاحظ نقص نشاط التيلوميراز في الممر 1 لأنه لا يتم التعبير عن TERT المسمى FLAG في الخلايا الأبوية. LC1 و LC2 نوعان من ضوابط تحميل قليل النوكليوتيد. F تحليل طول جزء تقييد التيلومير بواسطة لطخة جنوبية لخلايا HEK 293 الأبوية والعديد من النسخ المحررة التي تعبر عن FLAG-SNAP-TERT. تم حصاد الخلايا في النقاط الزمنية المحددة. تم رسم متوسط ​​أطوال التيلومير في اللوحة السفلية. المستنسخات 3 و 4 ، التي لديها مستويات أعلى من نشاط التيلوميراز كما هو موضح في اللوحة (هـ) ، لها تيلوميرات مطولة. ز فحص نشاط التيلوميراز المباشر للتيلوميراز المنقى من خلايا HEK 293 الأبوية والعديد من استنساخ HEK 293 و HeLa المُعدَّل باستخدام الجسم المضاد لـ TERT. تم نقل الخلايا باستخدام بلازميد تعبير تيلوميراز RNA (TR OE) للتأكد من أن FLAG-SNAP-TERT كان المكون المحدد لتجميع التيلوميراز. تم تضمين IP ctrl في عينة واحدة بعد تحلل الخلية لتأكيد أنه لا يؤثر على نشاط التيلوميراز. LC1 و LC2 نوعان من ضوابط تحميل قليل النوكليوتيد. تم رسم التحليل الكمي للبيانات في اللوحة السفلية

بعد ذلك ، قمنا بمقارنة IP لـ FLAG-SNAP-TERT باستخدام جسم مضاد FLAG مع ذلك باستخدام جسم مضاد TERT راسخ ، وهو مفيد لـ IP ولكن ليس للبقع الغربية [15 ، 16]. كعنصر تحكم داخلي لعنوان IP ، أضفنا ProA-FLAG-TERT غير النشط بشكل تحفيزي (التحكم في IP (IP ctrl)). تعد علامة ProA-FLAG أصغر من علامة FLAG-SNAP ، وبالتالي يتم تشغيل IP ctrl بحجم متوسط ​​بين TERT الداخلي و FLAG-SNAP-TERT على SDS-PAGE. تم إثراء FLAG-SNAP-TERT بكفاءة من مستنسخات HEK 293 المحررة ولكن ليس من الخلايا الأبوية (الشكل 2 ب الشكل S2b في ملف إضافي 1). (ترجع معظم الإشارة في الممرات 3-6 من الشكل 2 ب إلى FLAG-SNAP-TERT ، لأن عنصر تحكم IP موجود عند مستويات منخفضة كما يظهر في الممرات 1-2.) هوية FLAG-SNAP- تم التحقق من نطاق TERT من خلال اكتشافه مع كل من الأجسام المضادة لـ FLAG والأجسام المضادة لـ TERT (الشكل 2 ب). اكتشف كلا الجسمين المضادين أيضًا بسهولة التحكم في IP المضاف إلى خلايا HEK293 الأبوية ، والتي لا تحتوي على FLAG-SNAP-TERT. بالإضافة إلى ذلك ، كان يمكن اكتشاف FLAG-SNAP-TERT باستخدام التصوير الفلوري ، مما يشير إلى أن علامة SNAP تعمل بكامل طاقتها (الشكل 2 ب). تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام استنساخ هيلا المعدلة (الشكل S2b في ملف إضافي 1). قام IP مع الجسم المضاد TERT أيضًا بتنقية FLAG-SNAP-TERT من الحيوانات المستنسخة المحررة ولكن ليس الخلايا الأبوية (الشكل 2 ج الشكل S2c في ملف إضافي 1). بالإضافة إلى ذلك ، قام الجسم المضاد لـ TERT أيضًا بتخصيب TERT الداخلي من الخلايا الأبوية. من الغريب أن نطاقات TERT من النوع البري (WT) كانت موجودة أيضًا في النسخ التي تم تحريرها ، وربما يرجع ذلك إلى استخدام WT تيرت ابدأ الكودون.

لمقارنة كفاءة IP للأجسام المضادة لـ FLAG و TERT ، قمنا بتنفيذ IPs دون إضافة IP ctrl إلى النسخ التي تم تحريرها (كان IP ctrl لا يزال مدرجًا مع عينات الخلايا الأبوية ، نظرًا لأنه يمكن تمييزه بوضوح عن TERT الداخلي). في جميع خطوط الخلايا المحررة ، كان IP المضاد لـ FLAG أكثر كفاءة لتنقية TERT (قارن كل زوج من الممرات F و T في الشكل 2 د). أشار القياس الكمي لإشارة التألق إلى أن IP مع الجسم المضاد المضاد لـ FLAG قام بتنقية كميات أعلى بخمسة إلى سبعة أضعاف من FLAG-SNAP-TERT (الشكل 2 د). وبالتالي ، يوفر IP المضاد لـ FLAG تنقية أكثر كفاءة لـ TERT المعبر عنها من موضع كروموسومي داخلي من الطرق السابقة.

لتحديد مستوى التعبير عن FLAG-SNAP-TERT في الحيوانات المستنسخة التي تم تحريرها بالنسبة إلى TERT الداخلي ، قمنا بمقارنة كميات TERT و FLAG-SNAP-TERT المنقاة باستخدام IP المضاد لـ TERT (لم تتضمن عينات الشكل 2d من الحيوانات المستنسخة المحررة IP ctrl). بشكل غير متوقع ، كان FLAG-SNAP-TERT في الحيوانات المستنسخة المحررة موجودًا عند مستويات أعلى بحوالي 20 ضعفًا من TERT الذاتية في الخلايا الأبوية ، على الرغم من التعبير عن FLAG-SNAP-TERT من موقعها الداخلي. أشار تحليل PCR الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) إلى أن الحيوانات المستنسخة التي تم تحريرها عبرت عن مستويات أعلى من TERT mRNA مقارنة بالخلايا الأبوية (الشكل S2d في الملف الإضافي 1) ، مما يشير إلى تحسن تسلسل علامة FLAG-SNAP. تيرت النسخ و / أو استقرار TERT mRNA.

أخيرًا ، اختبرنا النشاط الأنزيمي لـ FLAG-SNAP-TERT لتحديد ما إذا كانت العلامة تتداخل مع الوظيفة التحفيزية لـ TERT. تم استخدام التيلوميراز المنقى باستخدام الأجسام المضادة FLAG و TERT في مقايسات تمديد التيلوميراز المباشر ، وقياس دمج dGTP المشع في التيلومير التمهيدي قليل النوكليوتيد. كما هو متوقع ، نتج عن مضاد TERT IP نشاط تيلوميراز من جميع الخلايا ، بينما أظهر مضاد FLAG IP نشاط تيلوميراز فقط في النسخ التي تم تحريرها (الشكل 2 هـ ، الشكل S2e في ملف إضافي 1). في النسخ التي تم تحريرها ، قام الجسم المضاد FLAG بترسيب نشاط تيلوميراز أكثر من أربعة إلى ثمانية أضعاف من الجسم المضاد TERT ، بما يتوافق مع الكفاءة المتزايدة لـ TERT IP (الشكل 2 د ، هـ). علاوة على ذلك ، في النسخ المعدلة 3 و 4 ، أسفرت IP مع الجسم المضاد TERT عن نشاط تيلوميراز أكثر بمرتين إلى خمسة أضعاف من الخلايا الأبوية ، بما يتوافق مع زيادة التعبير عن TERT. لم تظهر المستنسخات 1 و 5 نشاط تيلوميراز مرتفعًا ، وسبب هذا الاختلاف النسيلي غير معروف. وفقًا لذلك ، لاحظنا إطالة التيلومير في الحيوانات المستنسخة 3 و 4 ولكن ليس المستنسخات 1 و 5 (الشكل 2f). كان النشاط في استنساخ هيلا المحرر مشابهًا للنشاط المتزايد في HEK 293 المستنسخة 3 و 4 (الشكل 2g). من المفترض أن تكون ملاحظة أن الزيادة في نشاط التيلوميراز (أقل من خمسة أضعاف) أقل بكثير من الزيادة أضعاف في مستوى البروتين (20 ضعفًا) بسبب كمية التيلوميراز RNA (TR) ، المكون الرئيسي الآخر من النواة التحفيزية للتيلوميراز ، يحد من تجميع التيلوميراز. كان هذا متوقعًا من أرقام الجزيئات الذاتية لـ TERT و TR المقاسة سابقًا [6] ، وتمت الإشارة إليه أيضًا من خلال الإفراط في التعبير المؤقت لـ TR في النسخ المُعدلة ، مما زاد من نشاط التيلوميراز (الشكل 2g).

باختصار ، توضح هذه النتائج أن علامة FLAG-SNAP تسمح بكفاءة IP أعلى وتحتفظ بالنشاط الأنزيمي لـ TERT.

التوطين الخلوي لـ FLAG-SNAP-TERT

تم الاستدلال على توطين TERT في الخلايا البشرية من العديد من الدراسات مع البروتين الموسوم المفرط التعبير [17-20]. على الرغم من الإبلاغ عن تحديد الموقع الخلوي لـ TERT الداخلي [21 ، 22] ، فقد تم إحباط مثل هذه الدراسات بسبب قلة وفرة TERT وعدم وجود جسم مضاد جيد. هنا ، نستخدم FLAG-SNAP-TERT المعبر عنه من الموضع الداخلي كبديل لـ TERT الداخلي ، مدركين أن الإفراط في التعبير بسبب إدخال العلامة ، على الرغم من أنه أكثر تواضعًا من ذلك الناتج عن ترنسفكأيشن عابر قياسي ، يمكن أن يؤثر على النتائج. تم استخدام مستنسخات هيلا المعدلة بواسطة كريسبر في هذه التجارب لأن خلايا هيلا تلتصق بالسطح الزجاجي أفضل من خلايا HEK 293. قمنا بتسمية FLAG-SNAP-TERT باستخدام ركيزة منفذة للخلية لعلامة SNAP (BG-647-SiR) [23]. تم إصلاح الخلايا وتلطيخها لـ TRF2 و coilin لتصور التيلوميرات وأجسام Cajal ، على التوالي.

عرضت الخلايا التي تحتوي على FLAG-SNAP-TERT بؤرًا ساطعة في التيلوميرات وأجسام Cajal ، مواقع التوطين المتوقعة لـ TERT. لم يلاحظ أي تلطيخ نووي لـ TERT ، على عكس تجارب التألق المناعي السابقة (IF) باستخدام الجسم المضاد لـ TERT [17 ، 21]. أظهرت خلايا هيلا الأبوية تلطيخًا للخلفية فقط (الشكل 3 لصور مجال الرؤية الكاملة ، انظر ملفات البيانات 3-6 في ملف إضافي 3). تم تحليل Z-stacks للخلايا أيضًا لضمان التوطين المشترك (الشكل S3a في ملف إضافي 1). نظرًا لأنه يتم تجنيد الإنزيم تيلوميراز إلى التيلوميرات أثناء المرحلة S من دورة الخلية [21 ، 24] ، قمنا بمقارنة الخلايا المتزامنة في الطور S و G1 (الشكل 4 أ-ج للصور ذات مجال الرؤية الكامل ، انظر ملفات البيانات 3 و 7 و 8 في ملف إضافي 3). وجدنا أن كل نواة على شكل S تحتوي على ما يقرب من 40 بؤرة TRF2 (الشكل S3b في ملف إضافي 1) ، بدلاً من 150-300 تيلوميرات موجودة في خلية هيلا قبل النسخ المتماثل وبعده ، على التوالي. وبالتالي ، من المفترض أن البؤر تحتوي على مجموعات من حوالي أربعة إلى ثمانية تيلوميرات في المتوسط. تحتوي معظم خلايا المرحلة S على جزء صغير من مجموعات التيلومير التي تشترك مع TERT (

5٪). تشير هذه النتائج إلى أن عددًا صغيرًا فقط من التيلوميرات يتم استطالة في أي نقطة زمنية معينة ، حتى في المرحلة S.

التوطين الخلوي لـ FLAG-SNAP-TERT. تحليل IF لخلايا هيلا الثابتة التي تعبر عن FLAG-SNAP-TERT. تم تمييز علامة SNAP بصبغة SNAP-Cell® 647-SiR (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). تم تلطيخ أجسام التيلوميرات والكاجال بالأجسام المضادة ضد TRF2 والكويلين ، على التوالي. أظهرت الخلايا المحررة ولكن ليس الخلايا الأبوية بؤر FLAG-SNAP-TERT التي تم توطينها مع التيلوميرات وأجسام Cajal. تم استخدام نسختين مستقلتين تعبران عن FLAG-SNAP-TERT لإنشاء الصور المعروضة

يتم ترجمة TERT إلى التيلوميرات في S ولكن ليس المرحلة G1 من دورة الخلية. أ تحليل IF لخلايا هيلا الثابتة التي تعبر عن FLAG-SNAP-TERT ، متزامنة في طور G1 و S من دورة الخلية (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). عرضت الخلايا التي تعبر عن FLAG-SNAP-TERT بؤر TERT المترجمة عن التيلومير في S ولكن ليس المرحلة G1 من دورة الخلية ، بينما لم تظهر الخلايا الأبوية بؤر TERT المترجمة عن التيلومير. ب أظهر تحليل FACS لمحتوى الحمض النووي للخلايا المتزامنة في المرحلة S ذروة بين القمم 2 N و 4 N للخلايا غير المتزامنة ، مما يؤكد أنها كانت في المرحلة S. احتوت مجموعة خلايا G1 على قمم 2 N و 4 N ولكن تم استنفادها للخلايا ذات المحتوى الوسيط من الحمض النووي. تم تمييز 4 خلايا N ، التي فشلت في التحرر من توقفها الانقسامي ، بسهولة عن خلايا G1 من خلال شكلها المورفولوجي. ج التحديد الكمي لعدد بؤر TERT التي تمت ترجمتها بشكل مشترك مع إشارات TRF2 في خلايا هيلا المعدلة والمتزامنة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. تم إنشاء البيانات من تجربتين مستقلتين ، كل واحدة تحلل 50 خلية لكل حالة (يعني ± الانحراف المعياري). د تحليل FACS لمحتوى الحمض النووي لخلايا هيلا المحررة المنبعثة من كتلة ثيميدين مزدوجة أثناء انتقالها خلال المرحلة S. قبل الإطلاق ، كان عدد الخلايا يحتوي في الغالب على خلايا تحتوي على 2 N DNA ، والتي زادت تدريجياً مع خضوع الخلايا لتكرار الحمض النووي. بعد تسع إلى عشر ساعات من الإطلاق ، اكتمل تكاثر الحمض النووي ، كما يتضح من غالبية الخلايا التي تحتوي على 4 N من محتوى الحمض النووي. ه التحديد الكمي لعدد بؤر TERT المترجمة بشكل مشترك مع إشارات TRF2 في نقاط زمنية مختلفة أثناء الطور S (50 خلية لكل نقطة زمنية ، يعني ± خطأ معياري لمتوسط ​​الصور المقابلة ، انظر الشكل S4 في الملف الإضافي 1). أ. وحدات تعسفية يوديد البروبيديوم (PI)

لمزيد من تحليل توظيف التيلومير في التيلوميراز أثناء المرحلة S ، قمنا بمزامنة خلايا هيلا المحررة عند حدود G1 / S باستخدام كتلة ثيميدين مزدوجة وتوطين TERT المرئي للتيلوميرات مع تقدم الخلايا خلال المرحلة S (الشكل 4 د). زاد توطين TERT خلال أول 4-6 ساعات من المرحلة S ، وعند هذه النقطة وصلت إلى الحد الأقصى للتردد بمتوسط ​​حوالي ثلاثة مواقع مشتركة لكل خلية ، والتي تتوافق مع

7٪ من بؤر TRF2 (الشكل 4 هـ ، الشكل S4 في الملف الإضافي 1 لصور مجال الرؤية الكاملة ، انظر ملفات البيانات 3 ، 9-14 في ملف إضافي 3). بعد الانتهاء من تخليق الحمض النووي (9-10 ساعات بعد الإصدار) ، انخفض توطين TERT إلى الحد الأدنى (متوسط ​​حوالي توطين مشترك واحد لكل خلية) ، مما يشير إلى أن التيلوميراز ينفصل عن التيلوميرات في المرحلة G2 من دورة الخلية. تتوافق هذه الملاحظات مع النتائج السابقة التي تم الحصول عليها باستخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لـ TR ، وهو مكون الحمض النووي الريبي في التيلوميراز [21].

وبالتالي ، فإن علامة SNAP تمكّن التوطين الفرعي الخلوي لـ TERT المعبر عنه بشكل منخفض ، ويوضح توطينه في المواقع الوظيفية بيولوجيًا أن وظيفة TERT لا تتأثر بعلامة N-terminal FLAG-SNAP أو عن طريق التعبير الزائد المتواضع. كان عدد أجسام Cajal لكل خلية (عادةً ما يكون واحدًا إلى أربعة أجسام في الشكل S3c في ملف إضافي 1) لا يمكن تمييزه عن تلك التي لوحظت في خلايا HeLa الأبوية ، على عكس الخلايا ذات التيلوميراز المفرط التعبير حيث ترتبط أجسام Cajal الجديدة غير الطبيعية بكل تيلومير [ 19 ، 20]. تجدر الإشارة إلى أن الأجسام المضادة ضد FLAG-epitope لم تكتشف FLAG-SNAP-TERT في التيلوميرات ، بسبب بؤر الخلفية (ملف البيانات 3 ، 15 في الملف الإضافي 3) ، مما يشير إلى أن تصنيف SNAP أكثر تحديدًا من وضع العلامات IF التقليدي.

تعديل زوج قاعدة واحد في الذاتية تيرت المروجين

Recently, two highly recurrent point mutations were identified in the تيرت promoter in multiple cancers and shown to be associated with telomerase activation during tumorigenesis. To explore the effects of these mutations on TERT expression levels in the endogenous context, we extended our two-step “pop-in/pop-out” strategy to modify single base pairs in the تيرت promoter (Fig. 5a). A single base-pair substitution was first introduced into the تيرت promoter alongside an eGFP expression cassette, which was then removed by a second round of CRISPR-mediated editing, resulting in a تيرت promoter with only a single base-pair alteration.

Single base-pair modification at the endogenous تيرت المروجين. أ Outline of the protocol to modify a single base pair at the endogenous تيرت المروجين. First, a double-strand break was generated at the endogenous تيرت promoter next to the targeted base pair with the CRISPR-Cas9 system (red scissors). Cells that underwent HR with the DT containing the SV40-driven eGFP expression cassette and the single base-pair modification were screened by GFP signal and confirmed by PCR with primers a’, b, c’, and e’, the sequences of which are listed in Table S3 in Additional file 1. HA homologous arm, TSS موقع بدء النسخ. Next, the eGFP expression cassette was excised by two double-strand breaks generated by the CRISPR-Cas9 system. Cells that underwent HR with the DT containing the modified تيرت promoter sequence were screened based on the loss of the fluorescent signal and sequencing the PCR products generated with primers a’ and e’. ب Sample sequencing data demonstrating the reversion of the C-124T mutation from the تيرت promoter in SCaBER cells. Peak color: أحمر، ت لون أخضر، أ أزرق، ج أسود, G. ج TERT mRNA levels in the modified SCaBER clones are plotted relative to that in the parental cells (1.0, dashed line), as was measured by RT-qPCR with GAPDH mRNA as an internal control. ال black line in each group of data points indicates the median value. As a group, the three clones had significantly reduced mRNA levels relative to the parental cells (ص = 0.04 by Wilcoxon rank-sum test). د Telomerase activity in the modified SCaBER clones was lower than that in the parental cells, as measured by the IP-direct extension assay (LC loading control). Signal of the extension products on the gel was normalized to the LC signal and GAPDH protein levels in the IP input, which were quantified by western blot. The quantitative result is shown in the bar graph (mean ± standard deviation, n = 3 biological replicates, *ص < 0.05 by Student’s t-test). ه Telomeric restriction fragment length analysis by Southern blot in the parental cells and modified clones. Cells were harvested at the indicated time points. The average telomere length in each sample is plotted in the lower panel. *λ DNA-HindIII digest markers. F Growth curves for the parental cells and modified clones

The protocol was first tested using HEK 293T cells, which contain WT تيرت promoter sequences. Ten sgRNA sequences were tested, and a sequence directing Cas9 to cut between the −148 and −147 positions relative to the endogenous translational start site was chosen based on its targeting efficiency and position of cleavage (Table S1 and Fig. S5 in Additional file 1). The DT for the first step contained the C-146T mutation and an eGFP cassette inserted between base pairs −140 and −139, which disrupted the sgRNA recognition site. On days 6, 14 and 20 post-transfection, three rounds of FACS were carried out to enrich for the GFP-positive cells, from which single cell clones were generated. PCR with the primer pair a’–b or c’–e’ (Fig. 5a Table S3 in Additional file 1) was used to identify clones that had undergone HR. PCR with the primer pair a’–e’ suggested that both تيرت alleles had undergone HR (homozygous) in two clones, while in another three clones only one تيرت allele had undergone HR (heterozygous) (Fig. S6a in Additional file 1). Sequencing of the PCR products revealed that two out of the three heterozygous clones had a small insertion of two cytidines between −148 and −147 in the allele that had not undergone HR. Quantification of the TERT mRNA levels demonstrated that TERT expression was reduced to 10 % and 60 % of WT level in the homozygous and heterozygous clones, respectively, indicating that the insertion of the eGFP expression cassette in the تيرت promoter disrupted transcription (Fig. S6b in Additional file 1). The decrease in the TERT mRNA levels correlates with the decrease in the levels of TERT protein and telomerase activity, as well as telomere shortening (Fig. S6c, d in Additional file 1).

We then used a heterozygous clone (clone 5) to carry out the second step of the protocol, removing the eGFP cassette. Two Cas9-sgRNA plasmids targeting the edges of the eGFP cassette (Table S1 in Additional file 1) were co-transfected with the DT plasmid, which contained the sequence of تيرت locus from −589 to +353, and included the C-146T point mutation. Eight days post-transfection, the cell population was analyzed by FACS. The Cas9 − group (transfected with only the DT) contained

11.7 % GFP-negative cells, which could be due to epigenetic silencing of the eGFP expression cassette. The Cas9 + group contained a higher percentage of GFP-negative cells (

16.5 %). The GFP-negative cells in the Cas9 + group were used to generate single cell clones. Eighty clones were screened by PCR with the primer pair a’–e’ and sequencing, among which two were identified that had undergone HR to remove the eGFP expression cassette and had incorporated the C-146T mutation (Fig. S6e in Additional file 1). Copy number variation analysis verified that both clones have two copies of تيرت. The remaining clones either contained small indels or had lost one copy of the تيرت gene (Additional file 2). TERT mRNA levels in the two C-146T clones measured by RT-qPCR were not higher than that in the parental HEK 293T cells (Fig. S6f in Additional file 1). However, since TERT expression is activated through an alternative mechanism in HEK 293T cells, it is perhaps not surprising that the introduction of the تيرت promoter mutation did not lead to a further increase of TERT expression.

To determine the effects of the تيرت promoter mutations in a context where they would be functional, we used the established protocol to modify the تيرت promoter in SCaBER, a urothelial cancer cell line which contains two تيرت alleles, one of which carries the C-124T mutation [10]. Based on the hypothesis that the C-124T allele is more active in transcription than the WT allele, we targeted the C-124T allele to revert the mutation, since it has been suggested that the CRISPR-Cas9 system has increased accessibility in transcriptionally active regions [25]. A DT with the eGFP cassette inserted in the WT promoter sequence was used for the first step of editing. Out of 18 GFP-positive clones generated, 16 (89 %) contained the eGFP cassette inserted into the تيرت المكان. Based on sequencing results, we identified a clone in which the C-124T allele had undergone HR while the WT allele had neither undergone HR nor contained indels. This clone was subjected to the second round of genome editing to remove the eGFP cassette. Out of 200 clones analyzed by PCR and sequencing, three were found to contain only the WT تيرت promoter sequence (Fig. 5b). Copy number variation analysis demonstrated that all three clones had two copies of تيرت (Additional file 2), ruling out the possibility that the mutant تيرت allele was lost during editing.

To determine the effect of reverting the promoter mutation on TERT transcription, we analyzed TERT mRNA levels by RT-qPCR. The three clones exhibited reduced mRNA levels relative to the parental SCaBER cells (Fig. 5c). To assess whether the reduced TERT transcription had functional consequences, we tested the telomerase activity in these modified clones with direct telomerase extension assays following TERT IP. The cellular telomerase activity levels were decreased by 40–50 % in the modified clones compared with the parental cells (Fig. 5d). Consistent with these results, telomere shortening was observed in the edited clones (Fig. 5e). Furthermore, all clones grew at a slower rate compared with the parental cells (Fig. 5f). These results suggest that the C-124T mutation in the SCaBER cell line is necessary for full activation of TERT expression. Reverting the mutation in the تيرت promoter decreases telomerase levels and telomere length, and thereby limits the growth of these cancer cells.


ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor

activating transcription factor/cAMP-responsive element binding protein

bacterial artificial chromosome

basic fibroblast growth factor

cytomegalovirus immediate early

cyclization recombination recombinase

cofactor required for Sp1

CCAAT transcription factor

DNA nuclear targeting sequence

early growth response-1 gene

FKBP12 rapamycin-associated protein

green fluorescent protein

glucose-regulated protein 78

human artificial chromosome

human coagulation factor IX

human immunodeficiency virus

hypoxia responsive element

herpes simplex virus thymidine kinase

internal ribosome entry site

خميرة الخميرة mitochondrial endonuclease

IRES عبر-acting factor

kinase-like domain receptor

Locus of Crossing over of P1 phage

mammalian artificial episomal chromosome

magnetic resonance imaging

nuclear localization signal

origin of plasmid replication

polybromo BRG1-associated factor

platelet derived growth factor

platelet-endothelial cell adhesion molecule-1/CD31

progesterone receptor ligand binding domain

recombinant adeno-associated virus

remodeling and spacing factor

Rous sarcoma virus long terminal repeat

recombinant transcriptional activator

scaffold/matrix attachment region

smooth muscle gamma actin

transforming growth factor α

thyroid hormone receptor-associated protein

tetracycline transcriptional silencer

vascular endothelial growth factor

wild-type ص 53-activated fragment 1

yeast artificial chromosome


What is transfection?

من الذى: Scientists rely on transfection as a powerful technique to modulate gene expression in eukaryotic cells في المختبر و في الجسم الحي.

لماذا: عبرfection is the process that allows exogenous nucleic acids to bypass the cell membrane to enter into cells. Exogenous nucleic acids commonly used are plasmid DNA, RNA, siRNA and oligonucleotides. Once delivered into cells, nucleic acids modulate gene expression by driving overexpression or silencing of a gene of interest.

Gene overexpression is an indispensable tool for several applications, from understanding the role of gene of interest (gene studies, high-throughput screening), to the production of biologics such as antibodies (protein production) and recombinant viral particles, particularly for therapeutic purposes (virus production for gene & cell therapy).

Gene silencing is a method used to prevent expression of a gene of interest. The expression of a gene can be partially reduced (gene knockdown) or completely blocked (gene knockout). Because any gene can potentially be targeted, gene silencing is a prevalent technique used to develop gene-based therapies to address monogenic pathologies, cancer and in immunotherapy strategies.

How: Transfection of nucleic acids into cells cannot be achieved without the help of a transfection method. There are several physical methods that exist such as electroporation, sonoporation or microinjection but these processes are complex and relatively toxic for mammalian cells. To solve these issues, chemical-mediated transfection offers a great alternative: easiness of use, high transfection efficiency and excellent cell viability.

Chemical-mediated transfection

1) encapsulation of genetic material with transfection reagent

Nucleic acids are negatively charged due to their polyphosphate backbone and are thus able to interact with positively charged تعداء reagents (polymers or lipids). This results in the formation of تعداء complexes or nanoparticles, which protect nucleic acids from nuclease-mediated degradation.

2) Cellular uptake of nanoparticles

Most cells express negatively charged heparan sulfate proteoglycans on the external surface of their cell membrane, with which positively charged transfection complexes are able to interact. This interaction is key to trigger cellular uptake via an endocytosis process.

3) Release into the cytosol and if needed transport into the nucleus for transcription

Upon cellular uptake, transfection complexes are sequestrated into intracellular vesicles. Our transfection reagents are able to induce the release of the nucleic acids into the cytoplasm through vesicle membrane rupture or fusion. Most nucleic acids (oligonucleotides, siRNA, mRNA, etc…) stay in the cytoplasm where they are active. In case of gene transfer, plasmid DNA is transported into the nucleus for transient expression) which can become permanent after genome integration (stable expression).

Troubleshoot your transfection

When getting started with transfection, having additional tips and advice can be a real advantage to progressing seamlessly with your experiments. Even if you are not a novice in transfection, changing plasmid DNA construct, working with a new cell line or isolated primary cells can require fine-tuning. As transfection experts, we are always available to help you. Simply reach out to our Scientific Support Team:

In the meantime, you can also search through our regularly updated:

FAQ to answer the frequently asked questions we have received regarding our reagents and transfection experiments.

Cell Transfection Database with over 4000 publications, 1000 cell lines and primary cells. Transfection protcocols are available.


الحواشي

↵ § To whom correspondence may be addressed. E-mail: pnprasadbuffalo.edu or mks4acsu.buffalo.edu .

Author contributions: D.J.B., P.N.P., and M.K.S. designed research D.J.B., I.K., E.K.S., P.D., I.R., and N.K. performed research D.J.B., I.K., E.K.S., E.J.B., P.N.P., and M.K.S. analyzed data and D.J.B., E.J.B., and M.K.S. wrote the paper.

Abbreviations: ORMOSIL, organically modified silica SVZ, subventricular zone NSPC, neural stem/progenitor cell FGFR1, FGF receptor type 1 NLS, nuclear localization signal NGS, normal goat serum SN, substantia nigra SNc, SN par compacta TH, tyrosine hydroxylase LV, lateral ventricle SP, signal peptide.


Expression of Genes

Gene regulation makes cells different

Gene regulation is how a cell controls which genes, out of the many genes in its genome, are &ldquoturned on&rdquo (أعربت). Thanks to gene regulation, each cell type in your body has a different set of active genes&mdashdespite the fact that almost all the cells of your body contain the exact same DNA. These different patterns of gene expression cause your various cell types to have different sets of proteins, making each cell type uniquely specialized to do its job. Ultimately gene expression can involve changes in transcription or translation, but in eukaryotes, most gene expression control occurs at transcription.

For example, one of the jobs of the liver is to remove toxic substances like alcohol from the bloodstream. To do this, liver cells express genes encoding subunits (pieces) of an enzyme called alcohol dehydrogenase. This enzyme breaks alcohol down into a non-toxic molecule. The neurons in a person&rsquos brain don&rsquot remove toxins from the body, so they keep these genes unexpressed, or &ldquoturned off.&rdquo Similarly, the cells of the liver don&rsquot send signals using neurotransmitters, so they keep neurotransmitter genes turned off (Figure 1).

Figure 1. Different cells have different genes &ldquoturned on.&rdquo

There are many other genes that are expressed differently between liver cells and neurons (or any two cell types in a multicellular organism like yourself).

How do cells &ldquodecide&rdquo which genes to turn on?

Now there&rsquos a tricky question! Different cell types express different sets of genes, as we saw above. However, two different cells of the same type may also have different gene expression patterns depending on their environment and internal state.

Broadly speaking, we can say that a cell&rsquos gene expression pattern is determined by information from both inside and outside the cell.

  • Examples of information from داخل the cell: the proteins it inherited from its mother cell, whether its DNA is damaged, and how much ATP it has.
  • Examples of information from في الخارج the cell: chemical signals from other cells, mechanical signals from the extracellular matrix, and nutrient levels.

How do these cues help a cell &ldquodecide&rdquo what genes to express? Cells don&rsquot make decisions in the sense that you or I would. Instead, they have molecular pathways that convert information&mdashsuch as the binding of a chemical signal to its receptor&mdashinto a change in gene expression.

As an example, let&rsquos consider how cells respond to growth factors. A growth factor is a chemical signal from a neighboring cell that instructs a target cell to grow and divide. We could say that the cell &ldquonotices&rdquo the growth factor and &ldquodecides&rdquo to divide, but how do these processes actually occur?

  • The cell detects the growth factor through physical binding of the growth factor to a receptor protein on the cell surface.
  • Binding of the growth factor causes the receptor to change shape, triggering a series of chemical events in the cell that activate proteins called transcription factors.
  • The transcription factors bind to certain sequences of DNA in the nucleus and cause transcription of cell division-related genes.
  • The products of these genes are various types of proteins that make the cell divide (drive cell growth and/or push the cell forward in the cell cycle).

This is just one example of how a cell can convert a source of information into a change in gene expression. There are many others, and understanding the logic of gene regulation is an area of ongoing research in biology today.

Growth factor signaling is complex and involves the activation of a variety of targets, including both transcription factors and non-transcription factor proteins.

  • Gene regulation is the process of controlling which genes in a cell&rsquos DNA are expressed (used to make a functional product such as a protein).
  • Different cells in a multicellular organism may express very different sets of genes, even though they contain the same DNA.
  • The set of genes expressed in a cell determines the set of proteins and functional RNAs it contains, giving it its unique properties.
  • In eukaryotes like humans, gene expression involves many steps, and gene regulation can occur at any of these steps. However, many genes are regulated primarily at the level of transcription.

[reveal-answer q=&rdquo915423&Prime]Show References[/reveal-answer]
[hidden-answer a=&rdquo915423&Prime]

Alcohol dehydrogenase. (2016, January 6). Retrieved April 26, 2016 from Wikipedia: https://en.Wikipedia.org/wiki/Alcohol_dehydrogenase.

Cooper, G. M. (2000). Regulation of transcription in eukaryotes. في The cell: A molecular approach. Sunderland, MA: Sinauer Associates. Retrieved from www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9904/.

Kimball, John W. (2014, April 19). The human and chimpanzee genomes. في Kimball&rsquos biology pages. Retrieved from http://www.biology-pages.info/H/HominoidClade.html.

OpenStax College, Biology. (2016, March 23). Eukaryotic transcription gene regulation. In _OpenStax CNX. Retrieved from http://cnx.org/contents/[email protected] cription-Gene-.

OpenStax College, Biology. (2016, March 23). Regulation of gene expression. In _OpenStax CNX. Retrieved from http://cnx.org/contents/[email protected] ene-Expression

Phillips, T. (2008). Regulation of transcription and gene expression in eukaryotes. Nature Education, 1(1), 199. Retrieved from http://www.nature.com/scitable/topic. ession-in-1086.

Purves, W. K., Sadava, D. E., Orians, G. H., and Heller, H.C. (2003). Transcriptional regulation of gene expression. في Life: The science of biology (7th ed., pp. 290-296). Sunderland, MA: Sinauer Associates.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Eukaryotic gene expression is regulated at many stages. في علم الأحياء كامبل (10th ed., pp. 365-373). San Francisco, CA: Pearson.


Nucleus – Structure and Functions

  • نواة is a membrane bound structure that contains the cell’s hereditary information and controls the cell’s growth and reproduction.
  • Nucleus is present in all eukaryotic cells, they may be absent in few cells like the mammalian RBCs.
  • The shape of the nucleus is mostly round, it may be oval, disc shaped depending on the type of cell.
  • It is the command center of a eukaryotic cell and is commonly the most prominent organelle in a cell.
  • The nuclear envelope is a double membrane that separates the nucleus from the cytoplasm.
  • All traffic into and out of the nucleus passes through nuclear pores that bridge the double membranes.
  • Inbound traffic includes all nuclear proteins and ribosomal proteins destined for the nucleolus.
  • Outbound traffic includes mRNAs and ribosomal subunits.
  • The nuclear envelope consists of phospholipids that form a lipid bilayer.
  • The nuclear envelope is perforated with numerous pores called nuclear pores.
  • The envelope helps to maintain the shape of the nucleus and assists in regulating the flow of molecules into and out of the nucleus through nuclear pores.
  • The nuclear envelope is connected with the endoplasmic reticulum (ER) in such a way that the internal compartment of the nuclear envelope is continuous with the lumen of the ER.

  • الكروموسومات consist of DNA, which contains heredity information and instructions for cell growth, development, and reproduction.
  • When a cell is “resting” i.e. not dividing, the chromosomes are organized into long entangled structures called الكروماتينية and not into individual chromosomes.
  • Nucleoplasm is the gelatinous substance within the nuclear envelope.
  • النواة is not surrounded by a membrane, it is a densely stained structure found in the nucleus.

الانتماءات

Institute of Stem Cell Research (ISF), Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Germany

Markus Grosch, Sebastian Ittermann, Tobias Greisle, Chaido Ori, Adam C. O’Neill & Micha Drukker

Institute of Stem Cell Research (ISF), iPSC Core Facility, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Germany

Ejona Rusha, Anna Pertek & Micha Drukker

Comprehensive Pneumology Center (CPC), Helmholtz Zentrum München, Member of the German Center for Lung Research (DZL), Munich, Germany

Institute of Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Germany


شاهد الفيديو: Construction of a Plasmid Vector HD Animation (قد 2022).


تعليقات:

  1. Porrex

    هناك نقاط مثيرة للاهتمام!

  2. Tonya

    هل تفهمنى؟

  3. Ogier

    وظيفة لطيفة! لقد طرحت الكثير من الأشياء الجديدة والمثيرة للاهتمام بنفسي! سأذهب لإعطاء رابط لصديق في ICQ :)

  4. Atwood

    سؤالك كيف تنظر؟

  5. Golrajas

    أخطأ.

  6. Eadwardsone

    يا لها من إجابة جميلة

  7. Archambault

    أعتقد أنك تعترف بالخطأ. يمكنني إثبات ذلك.



اكتب رسالة